SN∕T 3505-2013 犬恶丝虫病检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3505-2013 犬恶丝虫病检疫技术规范Quarantine proocol for canine dirofilariasis 2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犬恶丝虫病检疫技术规范SN/T 3505-2013 兴中国标准而版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)64275323网址www.spc.且已 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴开本88012301/16 印张0.75字数18千字2013年8月第一版2013年8月第一次印刷印数1-1600 兴T号155066 2-25826 定价16.00兀SN/T 3505-2013 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草o本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本书Jll起草单位:中华人民共和作ILI川:1入境检验检疫同、LI川农业大学、中华人民共和|王I庆:1人境检验检疫局O本标准主要起草人:余华、杨光友、岳川、王皇、严玉宝、李应国、刘洋洋、陈世界、周由民江、胡娟、崔鹏事。SN/T 3505-2013 犬恶丝虫病检疫技术规范1 范围本标准规定了犬恶丝虫的检疫技术规范。本标准适用于犬恶丝虫的形态观察、PCR检测及抗体检测C2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的寻|用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 形态观察3.1 设备和器材3.1.1 普通离心机。3.1.2 光学显微镜。3.1.3 本视显微镜。3.1.4 fa平自iJ.材。3.2 试剂和材料3.2.1 2%(体积分数)甲醒水溶液C3.2.2 美蓝染色液，配制见附录A的A.103.3 微丝蝴观察(改良柯氏试验)采集待检动物外周血5mL，每毫升加入9mL2%甲醒水溶液，混合后1500 r/min离心10min，去上清液，取少量沉渣，美蓝染色，镜检观察，并拍照记录。犬恶丝虫微丝蝴的主要形态特征为:大小为(218m329,um)X(5，um7，um)，无辅膜，前段呈尖锥状，后端细长、较直O染色后虫体呈蓝色，参见附录Bo3.4 成虫观察解剖忠的功物-检查只右心室不11肺功脉。成虫虫体坐微山色，细长粉丝状。口由6个小明思的乳交|古|绕。雄虫长为12cm20 cm，后部呈螺旋状卷曲，有窄的尾翼膜，末端有尾乳突11对(月工前5对、月工后6对)，交合刺2根，长短不等。.虫长为25cm30 cm，尾端钝圆，阴门开口于食道后端，参见附录Bo4 PCR检测4.1 设备和器材4.1.1 移液器(10L、200L、1000，uL各一支)。SN/T 3505-2013 4.1.2 PCR 义。4.1.3;J(f山泳梢。4.1.4 pH i十。4.1.5 电子天平。4.1.6 冷冻离心机O4.1.7 凝胶成像分析系统o4.1.8 电泳仪。4.2 试剂和材料4.2.1 市售总DNA抽提试剂盒O4.2.2寻|物:DIDR-Fl 5-AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAG-3;DIDR-Rl 5-AGCGGGTAATCACGACTGA GTTGA-3 0 4.2.3 市售PCR缓冲液(含Mg2、T叫聚合酶等)。4.2.4 DL2000 DNA Marker 0 4.2.5 阳性对照品(恶丝虫阳性犬血浆)。4.2.6 阴性对照品(恶丝虫阴性犬血浆)。4.2.7 琼脂糟。4.3 操作方法4.3.1 DNA 抽才是采集疑似病犬的血液，取1.0 mL用总DNA试剂盒抽提血液中的DNA，操作步骤按照试剂盒说明书oDNA溶解于20L灭菌水中备用O4.3.2 扩t曾和检测25L扩增体系含:2 X PCR缓冲液12.5L，引物DIDR-F1(10 pmol/L)、DIDR-R1(10 pmol/f1L)各1.0f1L,血液总DNA1.0L，矶。10.5L，混匀后稍加离心。按参数:95 oc预变性5min;35 个循环:95 oc变性30s,60 oc复性30s,72 oc延伸30S;最后72oc延伸10min进行扩增O同时，以H20代替模板DNA作空白对照O每次试验加做|男性、5日性质控对照O反应结束后，取5.0 L PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳(10V/cm,30 min)0 4.4 结果分析若PCR产物出现约520怜的目的片段，则对目的产物进行测序，序列应与GenBa此中犬恶丝虫参考序列匹配率不小于93%0 PCR产物参考序列参见附录l-:o5 抗体检测(Dot-ELISA法)5.1 设备和器材5.1.1 恒温培养箱O5.1.2 硝酸纤维素膜(NC膜)。2 5.1.3 玻璃研钵。5.1.4 显做镜。5.1.5 一次性滤器(0.22m)。5.2 试剂和材料SN/T 3505-2013 以下所用的民剂，除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682规定的二级水。5.2.1 酶联葡萄球菌八蛋白(HRP-SPA)0 5.2.2 犬恶丝虫阳性血清。5.2.3 犬恶丝虫阴性血清o5.2.4 也被缓冲液，配制见A.20 5.2.5 封闭j夜，配制见A.30 5.2.6 PBS缓冲液，配制见A.405.2.7 PBST洗涤液，配制见A.;)0 5.2.8 底物溶液，配制见A.60 5.3 操作步骤5.3.1 虫体抗原制备用PBS缓冲液将从动物体内收集到的犬恶丝虫虫体清洗3次，再用玻璃研钵在冰浴上研磨，直到显微镜检查元完整虫体组织为止。然后将研磨好的组织匀浆倒入离心管中，-20 oC反复冻融5次，10 000 r/min 4 oC离心30min，取上洁液，无菌过滤(0.22m)后作为可溶性抗原，并测定蛋白质含量.分装后，-20 oC保存备用。5.3.2 诊断膜制备用铅笔在硝酸纤维素膜(NC膜)光滑面将膜划成5mmX5 mm小方块，将NC膜在蒸馆水中浸泡20 min，完全湿透后取出，室温晾干，备用O用包被缓冲液(pH9.6)将犬恶丝虫虫体粗抗原原液稀释至16.0 f1g/mL，备用。用微E加样器在小恪巾央淌加1f1L稀释好的虫体粗抗!辰，37oC保温30min;将但被好的NC膜浸入封闭液中，37oC封闭50min。将封闭好的膜片浸入PBST洗涤液中泡洗3次，每次5 mino置室温晾干，即为诊断膜。可放人密闭干燥的塑料袋中备用O5.3.3 ELISA检测每只待检动物采集血液5mL，分离血清用于检测O每次试验时均应设立阳性血清对照和阴性血清对照。检测步骤如1，1999。图B.4犬恶丝虫生活史已ON|的。山的同军附录(资料性附录)犬恶丝虫PCR产物参考序列C SN/T 3505-2013 5-AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAGCACAAAGATTTCGAATGCACATTGCACCATCGGGT TGATTCCCGATGGTACGTCTGGTTGAGGGTCAATATCGATCAGATTATCAAATAATATAC CAAAATTGATACATATGATACATATGAATGATATATGTTTTGGATATATTATTTGTTAA AATTAATTCATCAGGTGATGATGTGATGATAATCATTGAAAAATGACAAAAATCCCCTGA TTAAGTATAATAAAAATAGTAAGTAAAAAAGGCAAATTTTTACTTACAAAATATTACAT ATTGGAATAAATAATTTAATCTTTCATATATATAACTGTGATACATCATAAATATATAT ATAGCAAAAGAAAGATATAAATTATTATCATTTTTTTTGATCATTATTGCTATAATTAT TATCCTGCTTGTTTAACTATAATAATAGCAATGAATGAATCAAAATTTAAATGATACGTT AAAATCCAACCAATATGTTATAAATTTTCTTTCATTTTTGACCTCAACTCAGTCGTGATT ACCCGCT-3 书号:lSS66 2-2S826 定价:1巳16.00 SN/T 3505-2013