GA∕T 1637-2019 法庭科学 血液中甲磺隆等四种磺酰脲类除草剂检验 液相色谱和液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 血液中甲磺隆等四种磺酰脲类除草剂检验 液相色谱和液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for four sulfonylurea herbicides including metsulfuron in blood samplesLC and LC-MS -发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。本标准起草单位：北京市公安司法鉴定中心（一）。本标准主要起草人：杨士云、乔静、杨继锋、王燕燕、卫娟娜。GA/T 1 法庭科学 血液中甲磺隆等四种磺酰脲类除草剂检验 液相色谱和液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学血液中甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆和玉嘧磺隆的高效液相色谱（HPLC）定量检验方法和液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法。本标准适用于法庭科学血液中甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆和玉嘧磺隆的定性分析和定量分析。其他可疑样品中甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆的定性分析和定量分析可参照使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对血液进行提取、净化及浓缩，采用高效液相色谱法定量，液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。5 试剂及材料 5.1 试剂 实验用水应符合GB/T 6682中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括：a)甲醇（色谱纯）；b)乙腈（色谱纯）；c)甲酸（色谱纯）；d)乙酸乙酯；e)无水硫酸钠；f)中性氧化铝或硅镁吸附剂；g)0.1%甲酸水溶液：取1mL甲酸，用水稀释至1000mL；h)甲醇/水混合溶液（体积比1:9）：10mL甲醇与90mL水混合；i)标准溶液：GA/T 2 1)1.0mg/mL标准物质溶液：根据甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆标准物质的纯度，各称取适量，分别用乙腈配制1.0mg/mL甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期3个月。或采用市售标准溶液；2)0.1mg/mL混合标准工作溶液：移取1.0mg/mL的甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆标准物质溶液各1.0mL，用乙腈稀释至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期1个月；3)10.0g/mL混合标准工作溶液：移取0.1mg/mL的甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆标准物质溶液1.0mL，用乙腈稀释至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期1个月；4)1.0g/mL混合标准工作溶液：移取10g/mL的甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆标准物质溶液1.0mL，用乙腈稀释至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期1个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由1.0g/mL标准物质溶液用甲醇稀释得到。注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。5.2 材料 材料包括：a)具盖离心管；b)具塞玻璃试管；c)一次性注射器；d)有机系微孔滤膜：0.22m。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a)液相色谱-质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器；b)高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器（DAD）；c)电子天平；d)离心机；e)振荡器；f)超声波清洗器；g)移液器。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液样品 1.0mL2.0mL，加入乙酸乙酯 4.0mL8.0mL，超声振荡 10min，高速离心 5min，分离有机相，重复提取一次，合并两次提取的有机相，用无水硫酸钠脱水后，常温空气流下浓缩至干，残留物用乙腈 200L 溶解，用有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器分析。如需净化，按 7.1.1.2 操作。7.1.1.2 样品净化（中性氧化铝柱净化法）GA/T 3 净化过程包括：a）装柱：少许脱脂棉，依次加入无水硫酸钠 1g2g、中性氧化铝或硅镁吸附剂 2g5g、无水硫酸钠 2g3g；b）净化：用与提取液相同的溶剂 6.0mL 预淋洗装好的柱子，弃去预淋液，将检材样品提取液过柱，再用与提取液相同的溶剂 6.0mL 洗脱。收集合并过柱液及洗脱液，常温空气流下浓缩至干，残留物用乙腈 200L 溶解，用 0.22m 的有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器分析。7.1.1.3 质控样品制备 取等量空白血液样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加苯磺隆、甲磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为 50ng/mL(g)），与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱条件 7.1.2.1.1.1 参考条件一 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1mm100mm，3.5m）或等效色谱柱；注：ZORBAX Eclipse Plus C18柱是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液；c)梯度洗脱程序见表 1；表 1 梯度洗脱程序一 时间 min 乙腈 0.1%甲酸水溶液 0 20%80%2 50%50%4 90%10%8 20%80%d)流速：0.3mL/min；e)检测器：DAD 检测器或 UV 检测器；f)检测波长：250nm；g)柱温：30；h)进样量：10L。7.1.2.1.1.2 参考条件二 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1mm100mm，3.5m）或等效色谱柱；注：ZORBAX Eclipse Plus C18柱是安捷伦公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GA/T 4 b)流动相：A：甲醇，B：0.1%甲酸水溶液；c)流速：0.3mL/min；d)柱温：常温；e)检测器：DAD检测器或UV检测器；f)检测波长：250nm；g)进样量：10L；h)梯度洗脱程序见表2；表2 梯度洗脱程序二 时间 min 甲醇 0.1%甲酸水溶液 0 20%80%2 50%50%4 90%10%12 20%80%7.1.2.1.2 液相色谱-质谱条件 7.1.2.1.2.1 色谱参考条件 同 7.1.2.1.1 条件。7.1.2.1.2.2 质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；b)扫描方式：正离子；c)检测方式：多反应离子监测（MRM）；d)电喷雾电压：4936V；e)离子传输管温度：350；f)辅助器加热温度：350；g)雾化气：43 psi；h)辅助气：5Arb；i)鞘气：10 Arb;j)反吹气：8Arb；k)MS 参考条件（定性、定量离子对和射频电压、碰撞能量）件见表 3。表 3 MS 参考条件 名 称 定性离子对 定量离子对 射频电压 RF/V 碰撞能量 eV 苯磺隆 396.3155.2 396.3155.2 108.9 10 396.3364.0 10 396.3181.0 23 甲磺隆 382.1167.0 382.1167.0 116.2 10 382.1141.0 21 382.1199.2 16 GA/T 5 噻磺隆 388.3167.0 388.3167.0 122.5 16 388.3141.0 23 388.3204.8 27 玉嘧磺隆 432.1182.1 432.1182.1 174.1 15 432.1325.1 10 432.1251.0 40 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作液，按7.1.2.1中相应的分析条件进样分析。7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液样品1.0 mL2.0 mL两份，按7.1.1进行操作。另取等量空白血液样品三份，其中两份分别添加苯磺隆、甲磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆标准物质作为添加样品（添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(100 50)%），另一份作为空白样品，与检材平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作液，按7.1.2.1中相应的分析条件每个样品进样分析23次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于6次。7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 23 次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量：添样添样添样VMAVMAW=.(1)式中：W检材样品中目标物的含量，单位为微克每毫升（g/mL）；A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值；M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g）；V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL）；A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值；M样检材样品的取样量，单位为毫升（mL）；V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）。7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差：GA/T 6%10021=XXXRD.(2)式中：RD相对相差，用百分比（%）表示；X1、X2两个检材样品平行定量测定的含量数值；X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 4 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。表 4 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50%2050 1020 10%最大允许相对偏差 20 25 30%50%8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。四种除草剂相关研究数据及谱图参见附录A。GA/T 7 附 录 A（资料性附录）四种除草剂相关数据及谱图 A.1 四种除草剂的理化性质 A.1.1 甲磺隆（metsulfuron-methyl）又叫合力，通用名称：metsulfuron-methyl，其酸 metsulfuron。化学名称：2-（4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基氨基甲酰氨基磺酰基）苯甲酸甲酯，methyl 2-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-ylcarbamoylsulfamoyl)banzoate。分子式：C14H15N5O6S，分子量 381.4。理化性质：甲磺隆为无色晶体，熔点 158，蒸气压 0.3nPa（外推至 25）。溶解性：水1.1g/L（pH 值 5），水 9.5 g/L（pH 值 7）；（20）丙酮 36g/L，二氯甲烷 121g/L，乙醇 2.3g/L，己烷 0.79mg/L，甲醇 7.3g/L，二甲苯 58mg/L。亚酰胺基呈酸性，pKa 值为 3.3。稳定性：在空气中约 140以下稳定；在酸性溶液中水解。毒性：大鼠急性经口 LD50大于 5000mg（TC）/kg，兔急性经皮 LD50大于 2000mg/kg。A.1.2 苯黄隆（tribenuron-methyl）通用名称：tribenuron-methyl。商品名称：Express、Express TM，巨星，阔叶净。化学名称：2-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基(甲基)氨基甲酰氨基磺酰基)苯甲酸甲酯；methyl 2-4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl(methyl)carbamoylsulfamoylbenzoate；C15H17N5O6S=395.39。理化性质：该品为灰白色固体或亮棕色无味固体。熔点 141 C，蒸气压 0.036mPa（25）。20时在水中的溶解度为 28mg/L(pH 值 4)、50mg/L(pH 值 5)、280mg/L(pH 值 6)、2.04g/L(pH 值 7)。25时在丙酮中的溶解度为 43.8mg/L，在乙腈中为 54.2mg/L，在四氯化碳中为 3.12mg/L，在乙酸乙酯中为17.5mg/L，在正己烷中为 0.028mg/L，在甲醇中为 3.39mg/L。pKa 值为 5.0。在 45水解时，pH 值为810 下稳定，但在 pH 值小于 7 或 pH 值大于 12 下迅速分解。毒性：大鼠急性口服 LD50大于 5000mg/kg，兔急性经皮 LD50大于 2000mg/kg。A.1.3 噻磺隆（thifensulfuron-methyl）通用名称：thifensulfuron-methyl，酸为 thifensulfuron。商品名称：Harmony(Du Pont)、阔叶散。化学名称：3-（4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基氨基甲酰氨基磺酰基）噻吩-2-甲酸甲酯。Methyl 3-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-ylcarba moylsulfamoyl)thiophen-2-carboxylate。分子式 C12H13N5O6S2，分子量 387.4。理化性质：thifensulfuron-methyl 纯品为无色固体，熔点 186，相对密度 1.49，蒸气压 17nPa(25)。溶解度(25)：水：24 mg/L(pH 值为 4)、260 mg/L(pH 值为 5)、2.4 g/L(pH 值为 6)，丙酮中 11.9 g/L，乙腈：7.3 g/L，乙醇：0.9 g/L，乙酸乙酯：2.6g/L，己烷小于 0.1g/L，甲醇 2.6g/L，二氯甲烷 27.5g/L，二甲苯 0.2g/L。亚氨基呈酸性，pKa 值为 4.0（25）。稳定性：在 55稳定，在田间条件下无明显的光分解；在 45下水解。毒性：大鼠急性经口 LD50大于 5000mg/kg，兔急性经皮 LD50大于 2000mg/kg。GA/T 8 A.1.4 玉嘧磺隆(rimsulfuron；DPX-E9636)：化 学 名 称：1-(4,6-二 甲 氧 基 嘧 啶-2-基)-3-(3-乙 基 磺 酰-2-吡 啶 磺 酰)脲,1-（4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl）-3-(3-ethylsulfonyl-2-pyridylsulfonyl)urea，分 子 式：C14H17N5O7S2=431.4。理化性质：纯品为无色结晶体，熔点 176178。pKa 值为 4.1。密度 0.784(25)，蒸气压 1.510-6 Pa(25)。毒性：大鼠急性经口 LD50大于 5000 mg/kg，兔急性经皮 LD50大于 2000mg/kg。A.2 四种除草剂相关的回收率 四种除草剂相关的回收率见表A.1.表 A.1 血液添加提取分析的回收率 除草剂 浓度 RSD(n=5)回收率 苯磺隆 10 12.03%82.8%100 4.58%72.3%1000 3.02%63.1%甲磺隆 10 12.05%77.7%100 5.32%71.1%1000 5.18%71.6%噻磺隆 10 6.16%79.2%100 8.91%74.6%1000 6.20%66.4%玉嘧磺隆 10 12.12%79.2%100 7.13%73.7%1000 1.74%71.6%A.3 LC-MS 分析血液中磺酰脲类除草剂的线性方程、线性范围、定量限及检出限 LC-MS分析血液中磺酰脲类除草剂的线性方程、线性范围、定量限及检出限见表A.2。表A.2 血液添加磺酰脲类除草剂的线性方程 药物 线性方程 Y=ax+b R2 线性范围 ng/mL 定量限 ng/mL 检出限 ng/mL 苯磺隆 Y=0.0079x+0.3244 0.9996 10-1000 10 5 甲磺隆 Y=0.0219x-0.3459 0.9957 10-1000 10 2 噻磺隆 Y=0.0133x-0.1619 0.9990 10-1000 10 3 玉嘧磺隆 Y=0.0083x-0.0791 0.9984 10-1000 10 2 注：x:标准添加液中标准物质浓度，单位为微克每毫升（g/mL）。GA/T 9 A.4 四种除草剂的检出限 LC-MS 分析，甲磺隆、苯磺隆、噻磺隆、玉嘧磺隆的检出限分别为：2ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、2ng/mL。A.5 色谱参考条件一的液相色谱-质谱联用分析的色谱图 色谱参考条件一分析血液添加100 ng/mL磺酰脲类除草剂SRM选择离子色谱图见图A.1。说明：1-噻磺隆保留时间为 4.50 min；2-甲磺隆保留时间为 4.65min；3-玉嘧磺隆保留时间为 4.89min；4-苯磺隆保留时间为 5.41min。图 A.1 色谱参考条件一分析血液添加 100 ng/mL 磺酰脲类除草剂 SRM 选择离子色谱图 A.6 色谱参考条件二的液相色谱-质谱联用分析的色谱图 色谱参考条件二分析血液添加 100 ng/mL 磺酰脲类除草剂 LC-MS 色谱图见图 A.2。GA/T 10 说明：1-噻磺隆保留时间为 5.85 min；2-甲磺隆保留时间为 6.06min；3-玉嘧磺隆保留时间为 6.63min；4-苯磺隆保留时间为 6.93min。图 A.2 色谱参考条件二分析血液添加 100 ng/mL 磺酰脲类除草剂 LC-MS 色谱图 A.7 四种除草剂的质谱图 四种除草剂的质谱图见图A.3A.6。+M S2(387.90)CE(30):88 M CA scans from Sam ple 7(387.9)of ysy.w iff(Turbo Spray)M ax.2.3e5 cps.406080100120140160180200220240260280300320340360380400420440m/z,am u1.0e42.0e43.0e44.0e45.0e46.0e47.0e48.0e49.0e41.0e51.1e51.2e51.3e51.4e51.5e51.6e51.7e51.8e51.9e52.0e52.1e52.2e52.3e5Intensity,cps167.0388.3204.8141.0388.7295.1164.6231.9 图A.3 噻磺隆的质谱图 GA/T 11 +M S2(382.10)CE(20):113 M CA scans from Sam ple 1(382.1m s2)of ysy.w iff(Turbo Spray)M ax.5.0e5 cps.406080100120140160180200220240260280300320340360380400420440m/z,am u2.0e44.0e46.0e48.0e41.0e51.2e51.4e51.6e51.8e52.0e52.2e52.4e52.6e52.8e53.0e53.2e53.4e53.6e53.8e54.0e54.2e54.4e54.6e54.8e55.0e5Intensity,cps167.0382.1199.2141.0165.1349.9 图A.4 甲磺隆的质谱图 图A.5 玉嘧磺隆的质谱图 +M S2(396.10)CE(20):101 M CA scans from Sam ple 3(396.1m s2)of ysy.w iff(Turbo Spray)M ax.4.4e5 cps.406080100120140160180200220240260280300320340360380400420440m/z,am u2.0e44.0e46.0e48.0e41.0e51.2e51.4e51.6e51.8e52.0e52.2e52.4e52.6e52.8e53.0e53.2e53.4e53.6e53.8e54.0e54.2e54.4e5Intensity,cps155.2396.3364.0181.0199.1154.0360.2 图A.6 苯磺隆的质谱图 GA/T 12 A.8 四种除草剂的 DAD 光谱图 四种除草剂的DAD光谱图见图A.7A.10。图A.7 噻磺隆的DAD光谱图 图A.8 甲磺隆的DAD光谱图 图A.9 玉嘧磺隆的DAD光谱图 GA/T 13 图A.10 苯磺隆的DAD光谱图 _