SN∕T 2390-2009 国境口岸白蛉携带利什曼原虫检测方法(出入境检验检疫).pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 国境口岸白蛉携带利什曼原虫检测方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狀 犵狅 犳犔 犲 犻 狊 犺 犿 犪 狀 犻 犪狊 狆犻 狀狊 犪 狀 犱 犳 犾 狔犪 狋 犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录、附录、附录均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提取并归口。本标准由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：孙立新、丁永健、陈瑞、姚峰、宋锋林。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 国境口岸白蛉携带利什曼原虫检测方法范围本标准规定了国境口岸白蛉携带利什曼原虫的检测对象、生物安全要求、样品采集与处理、检测程序和结果报告。本标准适用于国境口岸白蛉携带利什曼原虫的实验室检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。实验室生物安全通用要求术语下列术语和定义适用于本标准。白蛉 狊 犪 狀 犱 犳 犾 狔属双翅目毛蛉科白蛉亚科，是一类体小多毛的吸血昆虫，可传播利什曼原虫病。全世界已发现 余种，我国已知有属 种（亚种），重要种类有中华白蛉和中华白蛉长管亚种。利什曼原虫犔 犲 犻 狊 犺 犿 犪 狀 犻 犪狊 狆 属于动基体目，锥虫亚目，锥虫科，利什曼属。是利什曼原虫病的病原体。生活史有前鞭毛体和无鞭毛体两个时期，前鞭毛体寄生于白蛉的消化道内，无鞭毛体寄生于人、犬科动物及其他脊椎动物的单核 巨噬细胞内。前鞭毛体狆 狉 狅 犿 犪 狊 狋 犻 犵 狅 狋 犲成熟的虫体呈梭形或长梭形，前端有一根伸出体外的鞭毛，为虫体运动器官。虫体大小为（）（）。检测对象国境口岸白蛉。生物安全要求 采集白蛉时应做好个人防护，防止被白蛉叮咬。样品处理应在无菌条件下进行。实验室结构和设施、个人防护、操作应符合 的要求。标本的采集和保存 采集方法标本采集采用捕蛉管捕集法。犛 犖犜 采集地点以国境口岸白蛉活动代表性生境为采样地，并在口岸货场、集装箱停放地、口岸生活区、山洞口、丛林地区、沿河、沿海区选择并设置监测点。样品保存将采集的白蛉置于无菌的试管中，贴好标签，带回实验室，分类鉴定备检。检测程序 样品处理 样品预处理将白蛉置于 冰箱 ，冷冻致死。样品处理将处死的白蛉置于无菌的试管内，管中加入少量无菌 的石碳酸生理盐水，轻摇试管以脱去白蛉体表的毛。取出脱去体毛的白蛉，移入另一支含有无菌生理盐水的试管内，反复洗涤两次。解剖白蛉具体操作参见附录。分离和培养前鞭毛体 直接涂片镜检将分离的白蛉消化道直接涂片，染液镜检。有时由于白蛉消化道的前鞭毛体较少，直接涂片，不易发现前鞭毛体。培养检测将白蛉消化道组织研碎，直接接种到 培养基内，培养 后，涂片镜检。具体培养方法参见附录。动物接种将白蛉消化道组织研碎，直接注入实验动物（小白鼠）的腹腔或皮下，个个月，解剖动物，取淋巴结涂片，镜检。前鞭毛体的涂片、染色与镜检具体操作参见附录。结果报告镜检发现无鞭毛体，报告利什曼原虫检测阳性。镜检未发现无鞭毛体，报告利什曼原虫检测阴性。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）白蛉的解剖犃 主要设备和材料解剖镜、解剖针、镊子、载玻片、解剖刀、无菌生理盐水。犃 操作方法犃 用镊子将去除体毛的白蛉置于载玻片上，在解剖镜下用解剖针除去翅与足。犃 将白蛉在无菌生理盐水中浸泡 ，再置于滴有无菌生理盐水的载玻片中。犃 左手用解剖针轻轻按住白蛉的中胸前方，右手用细小解剖刀或有刃的针于中胸背板中部稍后的地方至后足基部的直线上将颈管切断。犃 安排胸的后面一段标本的位置，使腹尖朝向解剖者的右侧，左手用解剖针在第七腹节后缘上从腹的背侧边压向腹的腹侧边缘，使腹内器官压向腹侧；然后，用右手持解剖针于第七腹节于第八腹节连接处的背侧割刻一小裂口，左手相反地用针从腹的腹侧边缘压向腹的背侧边缘，使腹内器官压向背侧，然后右手随即用针于腹部第九节连接处的腹侧上割刻一小裂口。犃 移动标本的位置，使白蛉的腹尖朝向解剖者的左侧，用左手的针轻轻横按于胸的后部使胸固定，用右手的针扎住第八腹节向后慢慢的拖牵，第八腹节便与第七腹节断离。再继续慢慢拖牵，腹内的生殖器官与消化器官就开始渐渐拖出。犃 待马氏管部分拖出后，即暂时停止拖牵，将连接于消化道各器官用针割断。然后边拖边停，使消化器官全部拖出。犃 用针将肠的后部切断，使胃及其所连接的部分消化器官与生殖器官分开。犃 将白蛉胃移入一滴加新鲜生理盐水的载玻片中，待检。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）前鞭毛体的培养犅 主要器材超净工作台、高压锅、温箱、三角烧瓶、试管。犅 培养基制备犅 洛克氏（犔 狅 犮 犽 犲）溶液的配制称取氯化钠（）、氯化钾（）、氯化钙（）、碳酸氢钠（）、葡萄糖，将以上药品混合溶于水中，溶解后加水至 ，高压灭菌后备用。犅 犖 犖 犖培养基成分琼脂 氯化钠蒸馏水 犅 犖 犖 犖培养基制备琼脂 ，氯化钠，蒸馏水 ，盛入烧瓶中加热熔化，分装试管，每管。灭菌 ，待稍冷却后每试管加入相当三分之一量的去纤维兔血，均匀混合后斜置待冷。冷却后每管加入 洛克氏溶液，冷藏备用。犅 前鞭毛体的接种和培养取白蛉的消化器官，切碎或用研钵研磨成匀浆，用白金耳挑取，直接接种于小培养基的表面，接种前将培养基内加入青霉素、链霉素各万单位，防止污染，置 温箱内培养。以上操作均要求严格无菌。犛 犖犜 附录犆（资料性附录）前鞭毛体染色和镜检犆 主要材料显微镜、水浴箱、染色缸、载玻片、白金耳、姬氏染液、生理盐水、甲醇、蒸馏水。犆 涂片犆 涂片时间选择经培养基培养 的前鞭毛体做涂片染色，此时的前鞭毛体生长正值旺盛阶段，其外型及内部结构完好清晰，为涂片染色的最好时机。犆 涂片方法先在干净的玻片上加一小滴生理盐水，再用白金耳挑取培养基表面的虫落，然后在玻片的生理盐水上轻蘸一下，用手轻摇玻片，使水滴散开，晾干后，甲醇固定，姬氏染色。犆 染色将姬氏染液与 值 的缓冲液以 的比例稀释混匀后进行染色。先将涂片置于染色缸中，然后将染色缸置入 水浴箱中，加温染色 ，以加强虫体对染液的渗透力。最后用蒸馏水冲洗晾干后，镜检。如需长期保存，则用加拿大胶封片。犆 镜检将载玻片置于显微镜下，先用高倍镜查找，再用油镜观察。培养的前鞭毛体常集结在一起，呈菊花状，单个前鞭毛体呈梭形，大小为（）（）。姬氏染色后，细胞质呈浅蓝色，细胞核紫红色、基体和鞭毛为红色、杆状的动基体为紫红色。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸白蛉携带利什曼原虫检测方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元