第八章 分子发光分析法(修改).ppt

第八章第八章 分子发光分析法分子发光分析法 一、一、分子荧光分子荧光(MF)(MF)分析法分析法 二、二、分子分子磷光磷光(MP)(MP)分析法分析法 三、三、化学发光化学发光分析法分析法Molecular Molecular Luminescence Luminescence Spectrometry,MLSSpectrometry,MLS2022/12/25第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法2022/12/25第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法2022/12/25第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法一、一、分子荧光与磷光产生过分子荧光与磷光产生过程程二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱三、荧光的产生与分子结构三、荧光的产生与分子结构关系关系四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素第一节 分子荧光与磷光2022/12/25 基基态态分分子子吸吸收收能能量量(电电能能、热热能能、化化学学能能或或光光能能等等)，电电子子由由基基态态跃跃迁迁到到激激发发态态，当当电电子子由由激激发发态态返返回回基基态态时时发发射射电电磁辐射磁辐射(即光即光)的形式释放能量，就称为的形式释放能量，就称为“发光发光”。M+能量能量 M*M +热量热量 M+h 分分子子吸吸收收了了光光能能而而被被激激发发，跃跃迁迁至至振振动动能能级级的的三三重重态态或或单重态，回到基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。单重态，回到基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。M+h M*M+h 荧光和磷光属于光致发光。荧光和磷光属于光致发光。一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程2022/12/25一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 依据分子结构理论讨论荧光及磷光的产生机理依据分子结构理论讨论荧光及磷光的产生机理。1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分分子子发发光光属属于于分分子子发发射射光光谱谱的的范范畴畴，光光发发射射过过程程涉涉及及分分子子内部电子能级的跃迁内部电子能级的跃迁。基基态态(S0)激激发发态态(S1、S2.)：吸吸收收特特定定频频率率的的辐辐射射；量量子化；跃迁一次到位；子化；跃迁一次到位；激激发发态态基基态态：多多种种途途径径和和方方式式,速速度度最最快快、激激发发态态寿寿命命最短的途径占优势最短的途径占优势。第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1、T2 。2022/12/252.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0或或1)。平平行行自自旋旋比比成成对对自自旋旋稳稳定定（洪洪特特规规则则），因因此此，在在同同一一激激发态中，三重态能级比相应单重态能级低发态中，三重态能级比相应单重态能级低。大多数有机分子的基态处于单重态大多数有机分子的基态处于单重态。S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通通过过其其他他途途径径(系系间间跨跨越越)；进入的几率小；进入的几率小。2022/12/25S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。2022/12/253.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁和无辐射跃迁(热热)等方式失去能量等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁 激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发光强度相对大；发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9 s,第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态；基态；磷光磷光：10-410s,第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态。延迟荧光延迟荧光2022/12/25辐射能量传递过程辐射能量传递过程荧光发射荧光发射：电子由：电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态各基态各振动能级振动能级(为为 S1 S0跃迁跃迁)，发射波长为发射波长为 2的荧光；发射时间的荧光；发射时间约为约为10-710-9 s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小发射荧光的能量比分子吸收的能量小,波长长波长长。磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态第一激发三重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态各各振动能级振动能级(T1 S0跃迁跃迁)。发光速度很慢：发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0 激发态激发态振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 2022/12/25二、荧光二、荧光(磷光磷光)激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱1.1.激发光谱激发光谱 固固定定发发射射波波长长(选选最最大大发发射射波波长长),),扫扫描描激激发发波波长长，可可获获得得化合物发射的荧光化合物发射的荧光(磷光磷光)强度与激发波长的关系曲线。强度与激发波长的关系曲线。荧荧光光和和磷磷光光均均属属于于光光致致发发光光，都都涉涉及及到到两两种种辐辐射射，即即光光的的吸吸收收和和发发射射，因因而而也也都都具具有有两两种种特特征征光光谱谱，即即激激发发光光谱谱和和发射光谱。发射光谱。通过激发光谱，选择最佳激发波长通过激发光谱，选择最佳激发波长发射荧光发射荧光(磷光磷光)强度最大的激发光波长，常用强度最大的激发光波长，常用ex表示。表示。2022/12/252.2.发射光谱发射光谱 固固定定激激发发波波长长(选选最最大大激激发发波波长长),),扫扫描描发发射射波波长长，可可获获得得化化合合物物发发射射的的荧荧光光(或或磷磷光光)强强度度与与发发射射波长关系曲线波长关系曲线。通通过过发发射射光光谱谱选选择择最最佳佳的的发发射射波波长长发发射射荧荧光光(磷磷光光)强度最大的发射波长，常用强度最大的发射波长，常用em表示。表示。2022/12/253.3.荧光光谱的基本特征荧光光谱的基本特征a.a.Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发发射射光光谱谱的的波波长长比比激发光谱的长激发光谱的长。产生原因：产生原因：激激发发态态分分子子由由于于振振动动弛弛豫豫及及内内部部转转移移的的无无辐辐射射跃跃迁迁，是是产产生位移主要原因；生位移主要原因；荧荧光光发发射射时时，分分子子基基态态不不同同振振动动能能级级也也发发生生振振动动弛弛豫豫至至最最低振动能级，也造成能量的损失；低振动能级，也造成能量的损失；外转换。外转换。2022/12/253.3.荧光光谱的基本特征荧光光谱的基本特征b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量(如如能能级级图图 2,1)，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再再跃跃迁迁回回到到基基态态各各振振动动能能级级，产产生生波波长长一一定定的的荧光荧光(如如 2)。c.荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。可由荧光发射光谱和吸收光谱的成因来解释。可由荧光发射光谱和吸收光谱的成因来解释。2022/12/25镜像规则产生原因：镜像规则产生原因：(b)基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布是是相相似的。似的。(a)激激发发光光谱谱(吸吸收收谱谱)的的形形状状表表明明了了分分子子第第一一激激发发单单重重态态的的振振动动能能级级结结构构，荧荧光光光光谱谱(发发射射光光谱谱)表表明明了了分分子子基基态态的的振振动动能级结构。能级结构。2022/12/25镜像规则产生原因：镜像规则产生原因：(c)根根据据Frank-Condon原原理理，电电子子跃跃迁迁过过程程中中核核的的相相对对位位置置不不变变（近近似似的的），若若吸吸收收光光谱谱中中某某一一振振动动带带的的跃跃迁迁几几率率最最大大，则则在在荧荧光光发发射射光光谱谱中中，其其相相反反跃跃迁迁的的几几率率也也应应最最大大(说说明明高高峰对高峰，低峰对低峰）峰对高峰，低峰对低峰）非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存在。非镜像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质存在。基于上述原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称基于上述原因，荧光发射光谱与吸收光谱之间显现镜像对称关系。关系。2022/12/25200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2022/12/25三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构）具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构的有机分子；的有机分子；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光衡量荧光物质发光能力。它表示激发分子发射出荧光(或或磷光磷光)的比例的比例或或2022/12/25 荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：荧光发射过程的速率常荧光发射过程的速率常数，取决于分子结构。数，取决于分子结构。各种无辐射跃迁过程的速各种无辐射跃迁过程的速率常数之和。率常数之和。取决于分子取决于分子所处的化学环境，所处的化学环境，同时也同时也与化学结构有关。与化学结构有关。磷光的量子产率磷光的量子产率p与荧光量子产率与荧光量子产率p相似。相似。2022/12/252.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1 1）跃迁类型：）跃迁类型：大大多多数数能能发发荧荧光光的的化化合合物物都都是是由由 *或或n*跃跃迁迁激激发发，然然后后经经过过振振动动弛弛豫豫等等无无辐辐射射跃跃迁迁，再再发发生生跃跃迁迁而而产产生生荧荧光。光。其中其中*跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。（2 2）共轭效应：）共轭效应：发发生生荧荧光光(或或磷磷光光)的的物物质质，其其分分子子都都含含有有共共轭轭双双键键(键键)的的结结构构体体系系。共共轭轭体体系系越越大大，电电子子的的离离域域性性越越大大，越越容容易易被被激激发发，荧荧光光也也就就越越容容易易发发生生，且且荧荧光光光光谱谱向向长长波波移移动动。大大部部分分荧荧光光物物质质都都具具有有芳芳环环或或杂杂环环，芳芳环环越越大大，其其荧荧光光(或或磷光磷光)峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。2022/12/25几种线状多环芳烃的荧光几种线状多环芳烃的荧光化合物量子产率F ex（nm）em（nm）苯萘蒽丁省戊省0.110.290.460.600.522052863653905802783214004806402022/12/25（3 3）刚性平面结构：）刚性平面结构：刚性平面结构刚性平面结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，减少能量的外部损失，用，减少能量的外部损失，故具有很强的荧光。如荧光素故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2022/12/25（4 4）取代基效应（）取代基效应（实验总结和推测）实验总结和推测）：取代基的性质取代基的性质(尤其是生色基团尤其是生色基团)对荧光体的荧光特性和强对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。度均有强烈的影响。给电子取代基使荧光加强给电子取代基使荧光加强供电子基团的有供电子基团的有-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN等。等。取代基的影响主要有以下几个方面：取代基的影响主要有以下几个方面：吸吸电电子基子基团团使使荧荧光减弱而磷光增光减弱而磷光增强强属于属于这类这类基基团团的的为为吸吸电电子基子基团团：如：如羰羰基基(-COOH，-CHO)，硝基，硝基(NO2)及重氮基等。及重氮基等。2022/12/25取代基位置的影响取代基位置的影响取取代代基基位位置置对对芳芳烃烃荧荧光光的的影影响响通通常常为为：邻邻位位，对对位位取取代代者者增增强强荧荧光光，间间位位取取代代者者通通常常抑抑制制荧荧光光。取取代代基基的的空空间间阻阻碍碍对荧光也有明显的影响。对荧光也有明显的影响。2022/12/25重原子效应：重原子效应：荧荧光光体体取取代代上上重重原原子子后后，荧荧光光减减弱弱，而而磷磷光光往往往往相相应应增增强强。芳芳烃烃这这种种效效应应称称为为“重重原原子子效效应应”。所所谓谓重重原原子子取取代，一般指的是卤素代，一般指的是卤素(Cl、Br和和I)原子取代。原子取代。由由于于重重原原子子中中，能能级级之之间间的的交交叉叉现现象象比比较较严严重重，使使得得荧荧光光体体中中的的电电子子自自旋旋-轨轨道道耦耦合合作作用用加加强强，系系间间跨跨跃跃显显著著增增加加，结果导致荧光强度减弱，磷光强度增强。结果导致荧光强度减弱，磷光强度增强。2022/12/25四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素外部因素外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除除一一般般溶溶剂剂效效应应外外，溶溶剂剂的的极极性性、氢氢键键、配配位位键键的的形形成成都将使化合物的荧光发生变化；都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。度增加，外转换去活的几率增加。低温荧光分析受到重视。低温荧光分析受到重视。荧光发射的主要电子跃迁类型荧光发射的主要电子跃迁类型*跃迁，跃迁，溶剂极性增大溶剂极性增大，荧光荧光光谱发生红移，而且荧光增强。光谱发生红移，而且荧光增强。不同温度下邻菲啰啉在不同温度下邻菲啰啉在邻二苯中的荧光光谱邻二苯中的荧光光谱2022/12/253.溶液溶液pH对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。的影响较大，需要严格控制。2022/12/254.4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象自自吸吸现现象象：化化合合物物的的荧荧光光发发射射光光谱谱的的短短波波长长端端与与其其吸吸收收光光谱谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收荧光物质发射的荧光的组分，溶液中含有能吸收荧光物质发射的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾；如色胺酸中的重铬酸钾；2022/12/255.5.荧光猝灭荧光猝灭荧荧光光分分子子与与溶溶剂剂分分子子或或者者其其他他分分子子之之间间存存在在相相互互作作用用，使使得荧光强度降低或消失的现象。得荧光强度降低或消失的现象。（1 1）碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。激发单重态激发单重态的荧光分子的荧光分子 猝灭剂分子猝灭剂分子 2022/12/25生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，是指基态的荧光物生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，是指基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。（2 2）生成化合物的猝灭）生成化合物的猝灭基态的荧光物质基态的荧光物质 猝灭剂猝灭剂（3 3）氧的猝灭）氧的猝灭 O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。氧对可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。确定说法，可能包含着多种机理。2022/12/254.4.荧光物质的自吸猝灭荧光物质的自吸猝灭 当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭自猝灭。自猝灭可能有如下几个原因：自猝灭可能有如下几个原因：(1)(1)荧光物质分子之间的碰撞能量损失荧光物质分子之间的碰撞能量损失;(2)(2)荧光物质的自吸收荧光物质的自吸收;(3)(3)荧光物质分子的缔合。荧光物质分子的缔合。2022/12/25第五章第五章 分子发光分析法分子发光分析法一、一、仪器与结构流程仪器与结构流程二、二、荧光分析法和应用荧光分析法和应用三、三、磷光分析法的应用磷光分析法的应用第二节 分子荧光与磷光分析法2022/12/25Cary Eclipse 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光、磷光化学荧光、磷光化学/生物发光生物发光美国瓦里安技术中国有限公司美国瓦里安技术中国有限公司2022/12/25光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。2022/12/25光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射单色器发射单色器发射单色器发射单色器1.1.荧光光度计荧光光度计仪器光路图仪器光路图2022/12/25光源光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见可见-紫外区紫外区)光源要求：光源要求：v发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱v光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小v有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命高高压压汞汞灯灯:是是以以汞汞蒸蒸气气放放电电发发光光的的光光源源，一一般般滤滤光光片片式式的的荧荧光计多采用它为激发光源。光计多采用它为激发光源。氙氙灯灯:是是目目前前荧荧光光分分光光分分度度计计中中应应用用最最广广泛泛的的一一种种光光源源。它它是是一一种种短短弧弧气气体体放放电电灯灯，具具有有光光强强度度大大，在在200800nm范范围内是连续光源的特点。围内是连续光源的特点。染料激光器染料激光器:是一种新型的荧光激发光源。是一种新型的荧光激发光源。2022/12/25I0ItIF,p检测器：检测器：现在的现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。荧光计多采用光电倍增管进行检测。样品池：样品池：荧光分光光度计荧光分光光度计的样品池四面透光。的样品池四面透光。单色器单色器：荧荧光光分分析析仪仪中中应应用用最最多多的的单单色色器器为为光光栅栅单单色色器器，光光栅栅有有两两块块，第第一一块块为为激激发发单单色色器器，用用于于选选择择激激发发光光的的波波长长，第第二二块块为为发发射射单单色色器器，用用于于选选择择荧荧光光发发射射波波长长。在在比比较较低低档档次次的荧光计中，采用滤光片作为单色器。的荧光计中，采用滤光片作为单色器。2022/12/252.2.定量依据与方法定量依据与方法(1)(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If 正比于正比于吸收的光强度吸收的光强度 Ia 和荧光量子效率和荧光量子效率：由朗伯由朗伯-比耳定律得：比耳定律得：荧光强度荧光强度If：2022/12/25对于稀溶液，当对于稀溶液，当 bC 0.05（磷光磷光 bC 0.01）时：时：If -荧光强度荧光强度I0 -入射光强度入射光强度f-荧光量子产率荧光量子产率b-吸收光程吸收光程 -摩尔吸光系数摩尔吸光系数C-物质浓度物质浓度 Ip -磷光强度磷光强度I0-入射光强度入射光强度p-磷光量子产率磷光量子产率b-吸收光程吸收光程 -摩尔吸光系数摩尔吸光系数C 物质浓度物质浓度2022/12/25（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：FCsFxCxFxFCsCx直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法荧光熄灭工作曲线法荧光熄灭工作曲线法比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。2022/12/253.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物无机化合物无无机机化化合合物物荧荧光光分分析析有有直直接接荧荧光光法法、荧荧光光猝猝灭灭法法、间间接接荧荧光光法及催化荧光法法及催化荧光法等。等。（a a）直接荧光法）直接荧光法 待待测测元元素素与与有有机机试试剂剂所所组组成成的的能能发发荧荧光光的的配配合合物物，通通过过检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。检测配合物的荧光强度以测定该元素的含量。（b b）荧光猝灭法）荧光猝灭法 某某些些元元素素虽虽不不与与有有机机试试剂剂组组成成会会发发荧荧光光的的配配合合物物，但但可可以以从从其其他他会会发发荧荧光光的的配配合合物物中中取取代代金金属属离离子子或或有有机机试试剂剂，组组成成更更稳稳定定的的不不发发荧荧光光配配合合物物或或难难溶溶化化合合物物，而而导导致致溶溶液液荧荧光光强度的降低，由荧光强度降低的强度来测定该元素的含量。强度的降低，由荧光强度降低的强度来测定该元素的含量。2022/12/25(2)(2)有机化合物和生物有机化合物和生物 具有荧光特性的有机化合物，生物、药物化合物可直具有荧光特性的有机化合物，生物、药物化合物可直接采用逆光荧光分析法测量。接采用逆光荧光分析法测量。目前研究热点：目前研究热点：激光诱导荧光研究溶液中单分子行为；激光诱导荧光研究溶液中单分子行为；荧光分子作为探针研究荧光分子作为探针研究DNADNA。（c c）间接荧光法）间接荧光法 间间接接荧荧光光法法常常用用于于某某些些阴阴离离子子如如F-、CN-等等的的分分析析，它它们们可可以以从从某某些些不不发发荧荧光光的的金金属属有有机机配配合合物物中中夺夺取取金金属属离离子子，而而释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。释放出能发荧光的配位体，从而测定这些阴离子的含量。2022/12/25磷光分光光度计磷光分光光度计光学系统与荧光分光光度计的区别光学系统与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别样品池与荧光分光光度计的区别盛液氮的石英杜瓦瓶盛液氮的石英杜瓦瓶。光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器斩波器（磷光镜）利用荧光和磷光发射寿命的差别利用荧光和磷光发射寿命的差别磷光发射，因其平均寿命较长，碰撞去激发的效应更大，磷光发射，因其平均寿命较长，碰撞去激发的效应更大，所以常采用低温磷光或固体磷光方法。所以常采用低温磷光或固体磷光方法。2022/12/25二、磷光分析法的应用二、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采采取取固固体体表表面面室室温温磷磷光光分分析析法法快快速速灵灵敏敏测测定定稠稠环环芳芳烃烃和和杂环化合物（致癌物质）；见表杂环化合物（致癌物质）；见表2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析等分析 检测限检测限0.01 g/cm-3 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 见表见表2022/12/252022/12/252022/12/25第五章 分子发光分析法一、一、基本原理基本原理二、化学发光分析的特点二、化学发光分析的特点三三 装置与技术装置与技术第三节 化学发光分析法2022/12/25一、化学反应发光基本原理某某些些物物质质在在进进行行化化学学反反应应时时，由由于于吸吸收收了了反反应应热热，而而使使反反应应产产物物分分子子激激发发到到激激发发态态，受受激激分分子子由由激激发发态态去去激激化化跃跃迁迁回回基基态态时时以以辐辐射射形形式式发发射射出出一一定定波波长长的的光光。这这种种吸吸收收化化学学能能使使分分子子激激发发并并发发光光的的过过程程，称称为为化化学学发发光光。利利用用化化学学发发光光建建立立起起来来的的分分析析方方法法称称为为化化学学发发光光分分析析法法。化化学学发发光光也也发发生生在在某些生物体系内，称为生物发光。某些生物体系内，称为生物发光。2022/12/25一、化学反应发光基本原理1.1.化学发光反应的类型化学发光反应的类型2.(1)(1)直接化学发光直接化学发光 A +B C +D*D*D+h(2)(2)间接化学发光间接化学发光A +B C +D*D*+F F*F*F+h 2022/12/25化学发光反应包含有化学激发和发光两个关键过程，化学发光反应包含有化学激发和发光两个关键过程，它必须满足下列条件：它必须满足下列条件：(1)(1)激发能的主要来源是反应焓，化学发光反应多为氧激发能的主要来源是反应焓，化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应焓相当化还原反应，激发能与反应焓相当E=170300 kJ/mol；位；位于可见光区；于可见光区；(2)(2)化学反应历程使反应产生的化学能用于不断地产生化学反应历程使反应产生的化学能用于不断地产生激发态分子；激发态分子；(3)(3)激发态分子跃迁回到基态时，以光辐射为主，具有激发态分子跃迁回到基态时，以光辐射为主，具有很高的量子产率。很高的量子产率。2022/12/252.2.化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：又称为又称为化学发光的总量子产率。化学发光的总量子产率。它它决定于决定于生成激发态产生成激发态产物分子的化学物分子的化学激发效率激发效率和激发态分子的和激发态分子的发射效率发射效率。定义为定义为:2022/12/253.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。每一个化学发光反应完全由参加反应物质的化学反应所决定。每一个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率。都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率。化化学学发发光光强强度度ICl即即单单位位时时间间内内发发射射的的光光子子数数，可可以以下下式式表示表示:式中式中表示表示t 时刻的化学发光强度，时刻的化学发光强度，是与分析物有关是与分析物有关的化学发光效率，的化学发光效率，dc/dt 是分析物参加反应的速率。是分析物参加反应的速率。化学发光强度化学发光强度2022/12/253.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性，通常，通常采用峰值光强度进行定量。采用峰值光强度进行定量。在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(A)，其其与被测物浓与被测物浓度成线性：度成线性：2022/12/254.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a.一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO +O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：发射的光谱范围：600875nm，灵敏度灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2+O（1000 C石英管中进行石英管中进行）SO2 +O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：最大发射波长：200nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；2022/12/25（2 2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮一氧化氮 NO +H HNO*HNO*HNO +h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：最大发射波长：690nm；在在富氢火焰中：富氢火焰中：NO2 +2H NO+H2O 该反应十分迅速；该反应十分迅速；2022/12/25b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2 +2H2 S +2H2O S +S 2S2*S2*S2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：最大发射波长：394nm；灵敏度：灵敏度：0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2022/12/25（3 3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。一现象可测定这些金属离子。2022/12/255.5.化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2）可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3）间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 +O2 酮酸酮酸 +NH3 +H2O2 氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 +O2+H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 +H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶2022/12/25 草酸二酯草酸二酯(能量提供体能量提供体)+高浓度双氧水高浓度双氧水+稠环芳烃稠环芳烃(能量接能量接受体受体)+金属离子金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷冷光源光源)。2022/12/25生物发光分析应用生物发光分析应用 在在pH 78；荧光素酶荧光素酶(E)和和Mg2+的存在下，的存在下，荧光素荧光素(LH2)与磷酸三腺甙与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP +LH2+E+Mg2+AMP LH2 E+Mg ppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：复合物与氧反应，产生化学发光：AMP LH2 E+O2 氧化氧化荧光素荧光素*+AMP+CO2+H2O氧化氧化荧光素荧光素*氧化氧化荧光素荧光素 +h 最大发射波长最大发射波长562nm；2022/12/25二、特点1.1.灵敏度极高灵敏度极高 荧光素酶和磷酸三腺甙荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定的化学发光分析，可测定2 10-17mol/L的的ATP，即可检测出一个细菌中的，即可检测出一个细菌中的ATP含量含量;2 2.仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；不需要光源、单色器和背景校正；3.3.发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；无背景光、散射光等干扰；4.4.线性范围宽线性范围宽5.5.分析速度快分析速度快缺缺点点：可可供供发发光光用用的的试试剂剂少少；发发光光反反应应效效率率低低（大大大大低低于于生生物体中的发光）；机理研究少。物体中的发光）；机理研究少。2022/12/252022/12/25三、装置与技术 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静静态态方方式式：用用注注射射器器分分别别将将试试剂剂加加入入到到反反应应器器中中混混合合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流流动动注注射射方方式式：用用蠕蠕动动泵泵分分别别将将试试剂剂连连续续送送入入混混合合器器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大。2022/12/25四、化学发光分析的应用化化学学发发光光分分析析最最大大的的特特点点是是灵灵敏敏度度高高，对对气气体体和和痕痕量量金金属属离离子子的的检检出出限限都都可可达达ngmL-1级级。在在环环境境检检测测中中化化学学发发光光法法比比吸吸收收光光谱谱法法和和微微库库仑仑法法具具有有更更高高的的灵灵敏敏度度，又又能能进进行行快快速速连连续续分分析析，因因此此气气相相化化学学发发光光反反应应已已广广泛泛用用于于空空气气中中有有害害物物质质如如O3、氮氮氧氧化化物物、CO、SO2、H2S等等的的监监测测。其其测测定定灵灵敏度可达敏度可达13ngmL-1。液液相相化化学学发发光光反反应应，如如鲁鲁米米诺诺、光光泽泽精精、没没食食子子酸酸等等发发光光体体系系可可测测定定天天然然水水和和废废水水中中的的金金属属离离子子。在在医医学学、生生物物学学、生生物物化化学学和和免免疫疫学学研研究究中中，化化学学发发光光分分析析也也是是一一种种重重要要的的手手段。段。2022/12/25