第五章 高效液相色谱(HPLC).ppt

高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)第五章第五章l色谱概述色谱概述lHPLC简介简介lHPLC的分类的分类lHPLC仪和图形分析仪和图形分析 什么是色谱什么是色谱?色谱法的简称色谱法的简称(又叫色层法又叫色层法,层析法层析法),),其本质是一种分离分析方法其本质是一种分离分析方法常见的分离方法常见的分离方法l蒸馏蒸馏l离心离心l电泳电泳l过滤过滤l色谱色谱(目前最有效的分离方法目前最有效的分离方法)色谱法简介色谱法简介色谱法色谱法(Chromatography)溯源溯源 100多年前俄国植物学家多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用分离植物色素时采用 的实验方法的实验方法 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下再加入石油醚使其自由流下,结果色素中结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带 Tswett用希腊语用希腊语chroma(色色)和和graphos(谱谱)描述他的描述他的实验方法，即现在的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法色谱法)色谱法的发展色谱法的发展色谱法是一种现代的分离方法色谱法是一种现代的分离方法 1906年正式命名年正式命名20世纪世纪30年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪世纪70年代年代色谱法原理色谱法原理色谱法的原理色谱法的原理是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配分配,吸附吸附等化学作用性能的差异等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时当两相作相对运动时,使各组分使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中有一相是固定的两相中有一相是固定的,叫作固定相叫作固定相(Stationary Phase),有一相是流动的有一相是流动的,称为流动相称为流动相(Mobile Phase),流流动相又叫洗脱剂动相又叫洗脱剂,溶剂溶剂相相(Phase):物理化学术语物理化学术语,特指在某一系统中特指在某一系统中,具有相同成分及相同具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面的界面色谱法原理色谱法原理分离是一个分离是一个物理过程。物理过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用(Interaction)色谱法的分类色谱法的分类按分离过程的机理分按分离过程的机理分:l吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)l根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离离l分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)l分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系分配系数数)不同不同l离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)l根据样品组份离子交换亲和力的差异分离根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱简称离子色谱(IC)(IC)l体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)(Size Exclusion Chromatography)lGPC(Gel Permeation Chromatography)GPC(Gel Permeation Chromatography)固定相是疏水性凝胶固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂流动相是有机溶剂lGFC(Gel Filtration Chromatography)GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是亲水性凝胶固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液流动相是水溶液色谱法的分类色谱法的分类按流动相的物态分按流动相的物态分:l气相色谱气相色谱(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相用气体作为流动相(又叫载气又叫载气)l液相色谱液相色谱(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流动相用液体作为流动相(又叫洗脱剂又叫洗脱剂)按固定相的形态分按固定相的形态分:l平面色谱平面色谱l纸色谱纸色谱l薄层色谱薄层色谱l柱色谱柱色谱色谱法分类示意图色谱法分类示意图lHPLC的产生lHPLC的固定相lHPLC的流动相HPLC的产生的产生l液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。l高效液相色谱法高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的是在经典液相色谱法的基础上基础上,于于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效小颗粒具有高柱效,但会引起高阻但会引起高阻力力,需用高压输送流动相需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC).又因分析速度快而称为高速液相色谱法又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现。也称现代液相色谱。代液相色谱。l高效液相色谱法高效液相色谱法 lHPLC(High Performance Liquid Chromatography)是一种区别于经典液相色谱是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高基于仪器方法的高效能分离手段效能分离手段:l高性能色谱柱高性能色谱柱,高精度输液泵高精度输液泵,高灵敏度检测器高灵敏度检测器l广泛应用于各个领域广泛应用于各个领域:医药医药,环保环保,石化石化,生命科生命科学学,食品工业食品工业,农业农业l无论在技术上无论在技术上,理论上理论上,还是在应用上仍有较大还是在应用上仍有较大的发展空间。的发展空间。高效液相色谱的固定相高效液相色谱的固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体刚性固体以二氧化硅为基质，可承受以二氧化硅为基质，可承受7.0 108 1.0 109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。相。硬胶硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为限为3.5 108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。多孔型固定相两类。1.1.表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它它的的基基体体是是实实心心玻玻璃璃球球，在在玻玻璃璃球球外外面面覆覆盖盖一一层层多多孔孔活活性性材材料料，如如硅硅胶胶、氧氧化化硅硅、离离子子交交换换剂剂、分分子子筛筛、聚聚酰酰胺胺等等。这这类类固固定定相相的的多多孔孔层层厚厚度度小小、孔孔浅浅，相相对对死死体体积积小小，出出峰峰迅迅速速、柱柱效效亦亦高高；颗颗粒粒较较大大，渗渗透透性性好好，装装柱柱容容易易，梯梯度度淋淋洗洗时时能能迅迅速速达达到到平平衡衡，较较适适合合做做常常规规分分析析。由由于于多多孔孔层层厚厚度度薄薄，最最大大允允许许量量受受到限制。到限制。2.全多孔型固定相全多孔型固定相 由由直直径径为为10nm的的硅硅胶胶微微粒粒凝凝聚聚而而成成。这这类类固固定定相相由由于于颗颗粒粒很很细细（510 m），孔孔仍仍然然较较浅浅，传传质质速速率率快快，易易实实现现高高效效、高高速速。特特别别适适合合复复杂杂混混合合物物分分离离及及衡衡量量分分析。析。液相色谱的流动相液相色谱的流动相 mobile phases of LC 1.1.流动相特性流动相特性 （1）液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗洗脱脱剂剂。流流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极极性性柱柱也也称称正正相柱。相柱。（3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。2.流动相类别流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分；按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 乙腈、水。乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环环己烷己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)。4.流动相的要求流动相的要求 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。（3）高纯度）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。（4）化学稳定性好）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。色谱法按分离机制的不同分为：色谱法按分离机制的不同分为：液固吸附色谱法液固吸附色谱法液液分配色谱法液液分配色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法分子排阻色谱法 亲和色谱法亲和色谱法液液-固色谱法固色谱法(吸附色谱吸附色谱)液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。分离，故也称为液固吸附色谱。吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。不能用该法分离分子量不同的化合物。液固色谱法的固定相液固色谱法的固定相 液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。可分为极性和非极性两种类型。非极性吸附剂最常见的是活性炭。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。和吡咯衍生物等。在液在液-固色谱中，选择流动相的基本原则固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。小的则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比如果样品组分的分配比k k值范围很广则使用梯值范围很广则使用梯度洗脱。度洗脱。液固色谱法的流动相液固色谱法的流动相 在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。分配系果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数数（K）或分配比（或分配比（k）小的组分，保留值小，先流小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。对分配系数有较大的影响。液液色谱液液色谱液液色谱法的固定相液液色谱法的固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：下列几类：（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为30 40 m的实心玻璃球和厚度约为的实心玻璃球和厚度约为1 2 m的多孔性外层所组的多孔性外层所组成。成。（2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30-50 m的多孔型颗粒。的多孔型颗粒。（3）全多孔型微粒载体，由）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为称堆积硅珠。这种载体粒度为5 10 m。由于颗粒小，由于颗粒小，所所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。由于液相色谱中，流动相参与选择作用，由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如种不同极性的固定液即可。如，氧二丙氧二丙腈（腈（ODPN），），聚乙二醇（聚乙二醇（PEG），），十八烷十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。和角鲨烷固定液等。液液色谱法的固定液液液色谱法的固定液液液色谱法液液色谱法的流动相的流动相 在液液色谱中，除一般要求外，还在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端，例如当选择固定液是极性物质个极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相时，所选用的流动相通常是极性很小的通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。溶剂或非极性溶剂。液液色谱的分类液液色谱的分类 以极性物质作为固定相，非极性溶剂作以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为流动相的液液色谱，称为正相分配色谱正相分配色谱，适，适合于分离极性化合物；合于分离极性化合物；反之，如选用非极性物质为固定相，而反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配反相分配色谱色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物芳烃及烷烃等化合物。离子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流流动动相相：阴阴离离子子离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用酸酸性性水水溶溶液液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基基本本原原理理：组组分分在在固固定定相相上上发发生生的的反反复复离离子子交交换换反反应应；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、电电荷荷、存存在在形式等有关。亲和力大，保留时间长；形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：阳离子交换：R-SO3H +M+=R-SO3 M +H+阴离子交换：阴离子交换：R-NR4OH +X-=R-NR4 X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成。其中，二乙烯苯起到交烯苯交联共聚而成。其中，二乙烯苯起到交联和加牢整个结构的作用，其含量决定了树联和加牢整个结构的作用，其含量决定了树脂交联度的大小。交联度一般控制在脂交联度的大小。交联度一般控制在4-16%范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，但选范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离子基团。酸碱基团作为可交换的离子基团。离子交换色谱法的固定相离子交换色谱法的固定相离子交换色谱法的流动相离子交换色谱法的流动相 离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。并改善样品的溶解度。排阻色谱排阻色谱size-exclusion chromatography 固定相：凝胶固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；原原理理：按按分分子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散到到凝凝胶胶空空隙隙，由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶溶剂剂分分子子小小，故在最后出峰。故在最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-105范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离 亲和色谱亲和色谱 原原理理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲和力，进行选择性分离。亲和力，进行选择性分离。先先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的所所谓谓间间隔隔臂臂(环环氧氧、联联胺胺等等)，再再连连接接上上配配基基(酶酶、抗抗原原等等)，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保保留留。改改变变淋洗液后洗脱。淋洗液后洗脱。lHPLC仪及各部件仪及各部件lHPLC结果分析结果分析液相色谱仪器（液相色谱仪器（1）high performance liquid chromatograph液相色谱仪（液相色谱仪（2）液相色谱仪（3）液相色谱仪（液相色谱仪（4）二、高效液相色谱法的特点二、高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速、高沸点、特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。三、流程及主要部件三、流程及主要部件1.1.流程流程2.主要部件主要部件(1)(1)高压输液泵高压输液泵l 主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。l为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），），液体液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。是高效液相色谱的特点之一。l应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置l外梯度外梯度:l利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色混合室，混合后进入色谱柱。谱柱。l内梯度内梯度:l一台高压泵一台高压泵,通过比通过比例调节阀例调节阀,将两种或多将两种或多种不同极性的溶剂按种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压一定的比例抽入高压泵中混合。泵中混合。(3)进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：(4)(4)液相色谱检测器液相色谱检测器l a.a.紫外检测器紫外检测器l 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。l 特点：特点：l 灵敏度高；灵敏度高；l 线形范围高；线形范围高；l 流通池可做的很小流通池可做的很小（1mm 10mm，容积容积 8L）；l 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；l 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；l 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。l b.b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；可可连连续续检检测测参参比比池池和和样样品品池池中中流流动动相相之之间间的的折折光光指指数数差值。差值与浓度呈正比；差值。差值与浓度呈正比；通通用用型型检检测测器器（每每种种物物质质具具有有不不同同的折光指数）；的折光指数）；灵灵敏敏度度低低、对对温温度度敏敏感感、不不能能用用于于梯梯度洗脱；度洗脱；偏偏转转式式、反反射射式式和干涉型三种；和干涉型三种；示差折光检测器示差折光检测器d.荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、药药物物、氨氨基基酸酸、甾甾类类化合物等有响应；化合物等有响应；(5)(5)高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱柱长长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。径以提高柱效。有人形容，柱是有人形容，柱是HPLC的心脏，可见在的心脏，可见在HPLC工作中选择柱的重要性。因为用不同工作中选择柱的重要性。因为用不同的柱，因其分离机理也不同，得到的效果也的柱，因其分离机理也不同，得到的效果也不同。通常有：反相不同。通常有：反相HPLC，疏水，疏水HPLC，凝胶过滤凝胶过滤HPLC，各种离子交换，各种离子交换HPLC，亲，亲和和HPLC等等。等等。对色谱工作者来讲，柱效是不离口的。对色谱工作者来讲，柱效是不离口的。新柱到货后，厂方都应有检查柱效的结果新柱到货后，厂方都应有检查柱效的结果报告附上。用户可以据此检查验收，但由报告附上。用户可以据此检查验收，但由于试剂、水质、仪器型号等方面的差异和于试剂、水质、仪器型号等方面的差异和运输过程的影响，按常规，柱效允许有运输过程的影响，按常规，柱效允许有10的差别。的差别。柱的分辨力和柱效的测定，一般采用柱的分辨力和柱效的测定，一般采用几种化合物为标淮，在特定的条件下进行几种化合物为标淮，在特定的条件下进行分离，并据此结果计算柱效。分离，并据此结果计算柱效。一、柱效的测定一、柱效的测定 以以Beckman公司的反相柱为例，采用公司的反相柱为例，采用一些小分子化合物，配置如下：一些小分子化合物，配置如下：Acetophenone(苯乙酮）苯乙酮）33mg，Nitrobenzene（硝基苯）（硝基苯）59mg，Benzene（苯）（苯）2g，To1uene（甲苯）（甲苯）3g，溶于，溶于3L甲醇中备用甲醇中备用,进样进样5ul，254nm检测。检测。在鉴定在鉴定Phenyl 5PW柱时用丙酮为柱时用丙酮为标准品，水作流动相标准品，水作流动相;在鉴定在鉴定CAA-HIC柱时用柱时用-胰蛋白酶原为标准品胰蛋白酶原为标准品(5mgm1，进样，进样5u1)，3.0M(NH4)2SO4,0.5M NH4Ac(pH 6.0)和和0.5M NH4Ac(pH 6.0)，20min内线性梯内线性梯度洗脱；度洗脱；在鉴定在鉴定DEAE-和和CM-柱时，分别用柱时，分别用Uric acid(0.1mgm1)和和Tryptamine(0.1mgml作标准品；作标准品；在鉴定在鉴定G2000SW 或或G3000SW时分别用时分别用Dextran(MW 500000)，PEG(MW 7500)和和PEG(MW 3000)或已知分子量的蛋白质为标或已知分子量的蛋白质为标准。准。此外还有此外还有Cyano-，IP-，Si-等柱，都可等柱，都可在厂商的资料中查阅到有关信息。在厂商的资料中查阅到有关信息。以应用生命系统以应用生命系统(applied biosystems)的微柱的微柱为代表，直接采用一些标准蛋白质来鉴定反相柱、为代表，直接采用一些标准蛋白质来鉴定反相柱、离子交换拄、疏水柱的分离效离子交换拄、疏水柱的分离效 果，这对生物化学果，这对生物化学工作者来讲，更加直观。工作者来讲，更加直观。这这5 5种蛋白质依次是：细胞色素种蛋白质依次是：细胞色素C、胰岛素、胰岛素、乳白蛋白、碳酸酐酶、卵白蛋白。有时也用核糖乳白蛋白、碳酸酐酶、卵白蛋白。有时也用核糖核酸酶，溶菌酶，胰凝乳蛋白酶原等。核酸酶，溶菌酶，胰凝乳蛋白酶原等。-乳球蛋乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液白的胰蛋白酶酶解液(多肽多肽)也用作鉴定柱效。也用作鉴定柱效。二、柱的新进展二、柱的新进展 1 微柱微柱(narrow column microcolumn)经典的柱是250mm4.6mm I.D,离子交换柱是75mm7.5mm I.D,而微柱内径是12mm，长度有30，100，150等等。微柱的优点微柱的优点是：分辨力至少和经典柱一样，长些的柱效果更好。长些的柱效果更好。回收率高。回收率高。因为柱的载体少，非专一性吸附少。灵敏度高灵敏度高。由于流速仅50200ul分钟(经典柱1m1分钟)，样品的峰尖窄,所以检出灵敏度增加。溶剂消耗少，节省运转费用溶剂消耗少，节省运转费用：以流速100ulmin，一个流程1小时计算，分析一个样品只需6m1洗脱液约仅消耗3m1乙腈。2无孔径载体柱无孔径载体柱(non-porous resin column)这种载体颗粒度约35um，表面无孔径，因此被分析的物质不会进入载体内部，而只在载体表面进行只在载体表面进行吸附、疏水结合或交换吸附、疏水结合或交换等，故可用于蛋白质和多肽的快速分析，一般流速1.5m1min只需几分钟即可完成。当应用经典的柱分离生物大分子时，通常使用较慢的流速，因为大分子进出柱介质孔径结构的速度较馒，如果为缩短时间而采用较快的流速，则分辨率下降。无孔径载体柱的发展克服了因蛋白质大分子进入载体颗粒内部而引起的局限性，解决了高流速时样品峰太宽及拖尾等问题。3灌注色谱灌注色谱(perfusion chromatography)它的载体颗粒结构中含有两类孔径，大的孔径有60008000A孔径，它比常规的HPLC柱载体的分离速度快10倍，而不降低分辨力,是大量制备蛋白质类产品很有潜力的方法。4毛细管毛细管HPLC 从1986年发展了微柱HPLC分离蛋白质和多肽，将HPLC流动相流速从经典柱(250mm4.6mm I.D)的1mL/min降低到50u1/min(用两个10 m1的注射泵产生梯度，这类泵的优点是没有脉冲，产生的梯度平稳)，1995年K.Yamada发展了毛细管HPLC，用2.5m1的注射泵，流速仅5u1/min，样品上样量525u1；柱为150 mm0.5mm I.D；梯度时变化小于10 n1/min。收集系统改为毛细管直接点涂在PVDF膜上，极其方便地定位峰和收集样品(图5-5)。如此收集在膜上的样品，可用刀片割成12mm，然后放在蛋白质序列仪的反应器上进行序列分析，Hsi等用在t-PA工作中，分析量在300fmol10 pmol之间。实际上，近年来已有十多家厂商生产毛细管柱,一般内径是0.32mm，长度150250mm，颗粒度35um，品种有正相，反相有C1(SAS)，C4(Butyl-)，C8(MOS)，C18(ODS)等。图5-6是肽谱分析图。从经典的柱(内径4.6mm)到微柱(内径约l2mm)，再从微柱到毛细管柱(内径0.5mm)。一般讲，内径小了一半，灵敏度可提高4倍(如从经典柱到微柱)，因此，毛细管HPLC的灵敏度比经典柱有了很大的提高。此外，由于用小内径的柱，流速也相应减小，又使灵敏度有进一步的增加。HPLC纯化条件纯化条件timeBuffer ABuffer B0min100%0%5min100%0%10min80%20%40min60%40%50min0%100%60min0%100%61min100%0%70min100%0%HPLC梯度设置表(例)HPLC的的图形图形结果结果l色谱图色谱图(Chromatogram):l 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图图,其纵坐标为信号强度其纵坐标为信号强度,横坐标为时间横坐标为时间色谱峰色谱峰时间时间(分分)基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值l第十次课液相色谱图名词术语液相色谱图名词术语(1)(1)l色谱图名词术语色谱图名词术语:l色谱峰色谱峰(Peak):(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的响应信号l峰底峰底(Peak Base):(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线l峰高峰高(Peak Height):(Peak Height):峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离l切线峰宽切线峰宽(Peak Width):(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与在峰两侧拐点处所作切线与 峰底相交两点之间的距离峰底相交两点之间的距离l半峰宽半峰宽(Peak Width at Half Height):(Peak Width at Half Height):通过峰高的通过峰高的 中点作平行于峰底的直线中点作平行于峰底的直线,其与峰两其与峰两 侧相交两点之间的距离侧相交两点之间的距离l色谱图名词术语色谱图名词术语:l峰面积峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积,又称响应值又称响应值l标准偏差标准偏差()(Standard deviation):0.607倍峰高对应峰倍峰高对应峰 宽的一半宽的一半l拖尾峰拖尾峰(Tailing Pea