第四章： 抗生素效价的微生物检定法.ppt

第四章：第四章：抗生素效价的微生物检定法抗生素效价的微生物检定法授课人授课人:汪穗福汪穗福(高级讲师高级讲师)苏惠虹苏惠虹(助理讲师助理讲师)广州市医药中专学校广州市医药中专学校教学目标：教学目标：.解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、解释抗生素概念、叙述医疗用抗生素特点、了解抗生素的主要作用机制了解抗生素的主要作用机制.叙述抗生素的效价和单位及其表示方法叙述抗生素的效价和单位及其表示方法.熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求.述说测定原理。述说测定原理。教学重点：教学重点：抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的效价和单位及其表示方法和单位及其表示方法 抗生素效价检定操作方法与基本要求抗生素效价检定操作方法与基本要求教学难点：教学难点：抗生素效价检定操作方法抗生素效价检定操作方法二剂量法效价计算公式二剂量法效价计算公式抗生素的主要作用机制抗生素的主要作用机制第一节第一节 概述概述第二节第二节 抗生素的效价和单位抗生素的效价和单位第三节第三节 管碟法测定操作管碟法测定操作第四节第四节 二剂量法二剂量法总结及作业总结及作业 第一节第一节 概述概述 一、抗生素的主要作用机制一、抗生素的主要作用机制 、抑制细胞壁的合成、抑制细胞壁的合成 、影响细胞膜的功能、影响细胞膜的功能 、干扰蛋白质的合成、干扰蛋白质的合成 、抑制核酸的合成、抑制核酸的合成 二、抗生素的概念二、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所产生的抗生素主要是由微生物所产生的极微量便具有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、极微量便具有选择性地杀死或抑制它种生物或肿瘤、细胞生长的一类天然有机化合物。细胞生长的一类天然有机化合物。三、医药用抗生素的特点：三、医药用抗生素的特点：(1)有较大的差异毒力有较大的差异毒力：差异毒力越强，越有利于临：差异毒力越强，越有利于临床应用。床应用。(2)抗菌活性强：抗菌活性强：MIC值越小，表示活性越强。值越小，表示活性越强。(3)抗菌谱广：广谱抗生素、窄谱抗生素抗菌谱广：广谱抗生素、窄谱抗生素 (4)不产生副作用和不良反应不产生副作用和不良反应 四、抗生素效价微生物测定技术四、抗生素效价微生物测定技术 （一）概述（一）概述 效价测定技术方法：效价测定技术方法：1、物理、化学法：物理、化学法：简便、快速，本简便、快速，本身纯度不高，采用该法会引起偏差，身纯度不高，采用该法会引起偏差，因此只有在纯度较高情况下可采用因此只有在纯度较高情况下可采用 2、微生物法：微生物法：原理和临床应用的要原理和临床应用的要求相一致，直接反映出抗生素的疗效，求相一致，直接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需用量较小，因此被且灵敏度较高，需用量较小，因此被广泛使用。广泛使用。微生物法：微生物法：依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据依据抗生素最小抑菌浓度而设计的稀释法；根据不同浓度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程不同浓度的抗生素对微生物生长速度的不同影响程度而设计的比浊法；有依据抗生素渗透到含敏感菌度而设计的比浊法；有依据抗生素渗透到含敏感菌的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计的管碟法的琼脂培养基中产生抑菌圈而设计的管碟法(又称扩又称扩散法，杯碟法或垂直扩散法散法，杯碟法或垂直扩散法)；根据对微生物呼吸抑；根据对微生物呼吸抑制程度而设计的呼吸度量法；根据对微生物代谢产制程度而设计的呼吸度量法；根据对微生物代谢产物的影响而设计的快速法，对微生物体内酶系统产物的影响而设计的快速法，对微生物体内酶系统产生影响的脱氢法。生影响的脱氢法。浊度法：浊度法：系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的种方法。测定供试品效价的种方法。管碟法：管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度浓度)与抑与抑菌圈的表面积或直径成正比。菌圈的表面积或直径成正比。（二）抑菌圈的形成（二）抑菌圈的形成 1、抑菌圈：抑菌圈：将不锈钢小管将不锈钢小管(俗称为牛津杯俗称为牛津杯)放置在含敏感试验菌的琼脂培养放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低，离小钢管愈远，距离增大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低。当抗生相应的抗生素浓度愈低。当抗生素分子扩散到一定时间，在小钢素分子扩散到一定时间，在小钢管周围形成一个能有效的抑制试管周围形成一个能有效的抑制试验菌生长的范围，也就是通常所验菌生长的范围，也就是通常所说的说的抑菌圈抑菌圈。2、影响抑菌圈大小的因素：影响抑菌圈大小的因素：抑菌圈的半径抑菌圈的半径(大小大小)与最小抑菌与最小抑菌浓度浓度C，琼脂层厚度，琼脂层厚度H，抗生素在琼脂，抗生素在琼脂内扩散系数内扩散系数D，抗生素在小钢管中的，抗生素在小钢管中的量量M，以及抗生素的扩散时间，以及抗生素的扩散时间T有关：有关：这些因素的改变，常会影响抑菌圈的这些因素的改变，常会影响抑菌圈的大小和清晰度。大小和清晰度。按设计原理不同分按设计原理不同分:管管碟碟法法一剂量法（标准曲线法）一剂量法（标准曲线法）二剂量法（二剂量法（22法）法）三剂量法（三剂量法（33法）法）日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果，日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果，必须使用三剂量法测定的结果仲裁。必须使用三剂量法测定的结果仲裁。3、管碟法常用的三种方法：、管碟法常用的三种方法：返回第二节第二节 抗生素的效价和单位抗生素的效价和单位 一、抗生素的效价和单位一、抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。时不加区别统称为效价单位。效价（效价（otency）：指检品的实际单位数）：指检品的实际单位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。单位（单位（unit,u）：是衡量抗生素有效成分）：是衡量抗生素有效成分的具体尺度。的具体尺度。二、抗生素的效价单位的表示方法二、抗生素的效价单位的表示方法、质量单位、质量单位 以抗生素的生物活性部分质量作以抗生素的生物活性部分质量作单位，微克（）单位，毫克单位，微克（）单位，毫克单位。单位。、类似质量单位、类似质量单位 以特定的纯粹抗生素盐类的以特定的纯粹抗生素盐类的质量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环质量作为单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）微克（）单位，毫克个微克（）单位，毫克个单位。单位。、质量折算单位、质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的以特定的纯抗生素盐的质量为单位而加以折算。质量为单位而加以折算。、特定单位、特定单位 以特定的抗生素样品的某一质以特定的抗生素样品的某一质量定为一单位。量定为一单位。复习旧课复习旧课:l1、抗生素是指主要由、抗生素是指主要由_生成的生成的_一类一类_化合物称之。化合物称之。l2、作为医疗用抗生素应具有、作为医疗用抗生素应具有、特点。特点。l3、抗生素效价的微生物检定法常用、抗生素效价的微生物检定法常用、方法进行。方法进行。l4、表示抗生素的效价和单位有、表示抗生素的效价和单位有、等方法。等方法。l5、中国药典规定的应用方法中、中国药典规定的应用方法中22法中第法中第1个与第个与第2个个2是分别表示是分别表示，而两个，而两个2则是分别表示则是分别表示意思。意思。返回教学目标：教学目标：熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求熟知抗生素效价检定操作流程与基本要求教学重点：教学重点：抗生素效价检定操作方法与基本要求抗生素效价检定操作方法与基本要求教学难点：教学难点：抗生素效价检定操作方法抗生素效价检定操作方法 第三节第三节 管碟法测定操作管碟法测定操作第三节第三节 管碟法测定操作管碟法测定操作 1.1.试验用菌液、缓冲液、培养基的制备试验用菌液、缓冲液、培养基的制备 按药按药 典规定进行制备。典规定进行制备。2.标准品与供试品溶液的制备标准品与供试品溶液的制备 按药典规定制备标准品按药典规定制备标准品与供试品高低不同浓度溶液。与供试品高低不同浓度溶液。3.双碟的制备双碟的制备 制备底层制备底层(每个培养皿每个培养皿20ML)及含一定量及含一定量试验菌的菌层试验菌的菌层(每个培养皿每个培养皿5ML)，并安置小钢管。，并安置小钢管。4.滴加药液到小钢管内滴加药液到小钢管内 将标准品、供试品溶液滴入相应将标准品、供试品溶液滴入相应的小钢管中。的小钢管中。5.培养培养 在恒温培养箱中培养至规定时间。在恒温培养箱中培养至规定时间。（注意更换成瓦盖）（注意更换成瓦盖）6.测量抑菌圈测量抑菌圈 可用手工测量或仪器测量。可用手工测量或仪器测量。7.计算结果计算结果 先进行可靠性测验先进行可靠性测验,符合规定符合规定,再进行效价计算再进行效价计算抗生素效价检定管抗生素效价检定管碟法碟法操作流程操作流程:标准品的称量标准品的称量 标准品的稀释标准品的稀释标准品溶液标准品溶液 供试品的称量供试品的称量 供试品的稀释供试品的稀释供试品溶液供试品溶液 缓冲液的制备缓冲液的制备 培养基的制备培养基的制备 底层底层20 ml菌层菌层5ml 平板的制备平板的制备 凝固后 凝固后 菌液的制备菌液的制备 加菌液加菌液 加小钢管加小钢管-可靠性测验，计算结果可靠性测验，计算结果 测量抑菌圈测量抑菌圈培培 养养 加陶瓦园盖加陶瓦园盖 二、影响因素的控制二、影响因素的控制 1直线斜率的控制直线斜率的控制 2直线截距的控制直线截距的控制 3抑菌圈大小的控制抑菌圈大小的控制 4培养基的厚度培养基的厚度 5.剂量反应直线范围控制剂量反应直线范围控制 6.抑菌圈圆整及清晰度的控制抑菌圈圆整及清晰度的控制 三、抗生素操作要求三、抗生素操作要求（1）防止抗生素污染）防止抗生素污染（2）操作次数序安排上的误差）操作次数序安排上的误差（3）测量抑菌圈应避免误差）测量抑菌圈应避免误差教学总结：教学总结：抗生素效价检定管抗生素效价检定管碟法碟法操作流程操作流程抗生素效价检定管抗生素效价检定管碟法碟法操作流程操作流程:标准品的称量标准品的称量 标准品的稀释标准品的稀释标准品溶液标准品溶液 供试品的称量供试品的称量 供试品的稀释供试品的稀释供试品溶液供试品溶液 缓冲液的制备缓冲液的制备 培养基的制备培养基的制备 底层底层20 ml菌层菌层5ml 平板的制备平板的制备 凝固后 凝固后 菌液的制备菌液的制备 加菌液加菌液 加小钢管加小钢管-可靠性测验，计算结果可靠性测验，计算结果 测量抑菌圈测量抑菌圈培培 养养 加陶瓦园盖加陶瓦园盖布置作业：布置作业：P92 综合测验题综合测验题 一、填空题一、填空题 7、8 二、填图题二、填图题 返回第四节第四节 二剂量法二剂量法 二剂量法的原理与测定方法：二剂量法的原理与测定方法：该法系将抗生素的标准及检品各稀该法系将抗生素的标准及检品各稀释成一定比例释成一定比例(2:1或或4:1)的二种剂量，的二种剂量，即高剂量和低剂量。在同一培养基平即高剂量和低剂量。在同一培养基平皿上进行对比，根据它们所产生的抑皿上进行对比，根据它们所产生的抑菌圈大小计算检品的效价。菌圈大小计算检品的效价。一、效价计算公式一、效价计算公式 二剂量法效价计算公式经推导可得出供试品二剂量法效价计算公式经推导可得出供试品的效价计算公式。的效价计算公式。V=T1+T2 S1 S2 （43）W=T2 T1+S2 S1 （44）LgR=(W/V).I （45）R=lg1(W/V).I （46）pT=AT.R （47）Lg=(V/W).I （48）=lg-1.(V/W).I （49）二、操作方法二、操作方法基本要点：基本要点：高剂量抗生素溶液所形成的抑菌圈直径在高剂量抗生素溶液所形成的抑菌圈直径在2024 mm，个别抗生素的抑菌圈可在，个别抗生素的抑菌圈可在1824 mm；高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差数可较小；，有些抗生素的差数可较小；高、低剂量之比一般用高、低剂量之比一般用2:1，当高、低剂量，当高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之比为比为4:1的比率。的比率。操作步骤：操作步骤：1.称量称量 2.稀释稀释 3.双碟的制备双碟的制备 4.放置钢管放置钢管 5.滴加抗生素溶液滴加抗生素溶液 6.抑菌圈测量抑菌圈测量图图4 46 6：钢管放置器：钢管放置器（北京先驱威锋技术开（北京先驱威锋技术开发公司生产开发）发公司生产开发）返回 教学总结：教学总结：抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素概念、医疗用抗生素特点、抗生素的主要作用机制。抗生素的主要作用机制。布置作业：布置作业：P91-92 综合测验题综合测验题返回标准品的标准品的称量称量标准品标准品返回 试验用菌液、缓冲液、培养基、试验用菌液、缓冲液、培养基、标准品与供试品溶液的制备标准品与供试品溶液的制备 制备过程制备过程返回 抽抽提提加入乙醚进行抽提加入乙醚进行抽提共共抽提三次抽提三次(取其下层取其下层)返回双碟的制备双碟的制备 制备底层制备底层制备菌层制备菌层放置小钢管放置小钢管返回 滴加药液到小钢管内滴加药液到小钢管内 返回 在恒温培养箱中培养至规定时间在恒温培养箱中培养至规定时间 （盖上陶瓷盖）（盖上陶瓷盖）返回测测量量抑抑菌菌圈圈测量过程（活动）测量过程（活动）方法一方法一测量仪器测量仪器方法二方法二测量过程（活动）测量过程（活动）返回计算结果计算结果返回