实验十六、RNA的定量测定.ppt

实验十六实验十六 RNA的定量测定的定量测定一、实验目的一、实验目的 掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。二、原理二、原理 当RNA与地衣酚试剂在沸水中加热时，RNA被酸降解，所产生的核糖进一步转变为糠醛，它与地衣酚(3，5-二羟基甲苯)在高铁离子的催化下可反应生成绿色物，后者在670nm处有最大吸收峰，在10100mg/mL范围内其光密度值与RNA浓度有线形关系。三、试剂和器材三、试剂和器材 1.试剂 0.1mg/mL标准RNA溶液、地衣酚试剂、2.器材 可见分光光度计、恒温水浴锅四、操作步骤四、操作步骤 1.标准曲线的绘制 取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。试管试管012345标准标准RNA/mL00.40.81.21.62.0蒸馏水蒸馏水/mL21.61.20.80.40地衣酚试剂地衣酚试剂/mL222222混合均匀后，置沸水混合均匀后，置沸水浴中加热浴中加热45min45min，冷却，在冷却，在670nm670nm波长处比色波长处比色光密度值光密度值 2.样品的测定 取待测样品1mL，加蒸馏水1mL及二苯胺溶液2mL，沸水浴保温45min，冷却，然后在670nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的RNA的mg数，按下式计算待测样品的RNA的含量。RNA%RNA%待测样品中测得的待测样品中测得的RNA的的m mg数数待测样品液中样品的待测样品液中样品的m mg数数X 100 五、注意事项五、注意事项 样品蛋白质含量高时，应先用5TCA沉淀蛋白质；有较多DNA样品时也会发生干扰，可在试剂中加适量的CuCl2.H2O，可减少DNA的干扰。六、思考六、思考题