基因表达沉默技术.ppt

药学系药物基因组学教研室药学系药物基因组学教研室2010.06.18 2010.06.18 基因表达沉默技术基因表达沉默技术1教学内容及要求1234反义核酸技术反义核酸技术核酶技术核酶技术基因敲除技术基因敲除技术RNA干扰干扰 技术技术 重点重点 熟悉熟悉2参考资料 基因工程及其分子生物学基础基因工程及其分子生物学基础-基因基因工程分册工程分册，北京大学出版社，静国，北京大学出版社，静国忠编忠编 自备材料（个人实践经验）自备材料（个人实践经验）3第一节第一节 RNA干扰干扰技术技术4基本概念 掌握掌握 RNA RNA 干干扰扰 (RNA(RNA interference,interference,RNAiRNAi):):由由小小双双链链RNARNA诱诱发发的的、同同源源mRNAmRNA高高效效特特异异性性降降解解的现象的现象。小小干干扰扰RNA:RNA:具具有有干干扰扰功功能能的的这这种种短短双双链链RNARNA就就称称为为小小干干扰扰RNARNA（Small Small interfering interfering RNA,siRNARNA,siRNA)。5注射注射sense秀丽线虫秀丽线虫antisense注射注射1995年年发现历史6反义反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱；对基因抑制效应比较微弱；而双链而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的）能够高效特异性阻断靶基因的表达。表达。1998年年7 Craig C.Mello克雷格梅洛Andrew Z.Fire安德鲁安德鲁菲尔菲尔2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine8随随后后陆陆续续发发现现RNAiRNAi也也存存在在于于水水稻稻、烟烟草草、果果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi现象的普遍性9靶靶RNAi 机制siRNA在在ATP参参与与下下形形成成RISC复复合合体体，被被RNA解解旋旋酶酶解解旋旋成成单单链链，并并由由其其中中的的反反义义链链指指导导移移至至靶靶mRNA，靶靶mRNA被被切切割割后后诱诱发发宿宿主主细细胞胞针针对对这这些些mRNA的的降降解解反应。反应。外外源源长长dsRNA在在ATP作作用用下下被被RNase Dicer切切割割成成21nt左左右右、由由正正义义和反义链组成的和反义链组成的siRNA重点重点10siRNA19 bp duplex2 nt 3 overhangs21 nt siRNA实验设计难点难点111 1）靶序列的调出）靶序列的调出http:/National Center forBiotechnology Information1213142 2）利用免费设计软件进行）利用免费设计软件进行siRNAsiRNA设计设计InvitrogenTakaraOligoegine15软件软件的选择的选择原则原则1 1、选选择择可可读读框框内内、翻翻译译起起始始位位点点之之后后5050100nt100nt的序列作为靶序列；的序列作为靶序列；2 2、选择的靶位、选择的靶位55端之前的两个碱基为端之前的两个碱基为AAAA；3 3、GCGC含量控制在含量控制在35%35%65%,65%,最好最好50%50%左右；左右；4 4、碱基数目控制在、碱基数目控制在191921nt21nt；5 5、避免连续、避免连续3 3个或个或3 3个以上的相同碱基；个以上的相同碱基；6 6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；7 7、靶序列同数据库进行、靶序列同数据库进行BLASTBLAST同源性比对。同源性比对。16我用的软件：我用的软件：siDirectsiDirect173 3）siRNAsiRNA合成或表达合成或表达RNARNA聚合酶聚合酶启动子（包括启动子（包括U6U6或或H1H1）：）：转录起始点明确；转录起始点明确；转录生成小转录生成小RNARNA；转录产物无转录产物无polyApolyA尾；尾；转录终止为转录终止为5 5个连续的个连续的U U。181920213 mg/ml 正向引物 1 l3 mg/ml 反向引物 1 l90C 4 min70C 10 min室温订购合成的引物序列退火订购合成的引物序列退火224)siRNA working?23mRNA:Real-time PCRmRNA:Real-time PCR Protein:Western blot Protein:Western blot17siRNA Mock 17siRNA Mock 245)5)合成合成oror构建载体？构建载体？A.A.化学合成化学合成siRNAsiRNA：B.B.瞬时转染瞬时转染C.C.实验花费高实验花费高D.D.使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPCDEPC）处理过的）处理过的灭菌蒸馏水溶解，这是因为灭菌蒸馏水溶解，这是因为siRNAsiRNA易被易被RNARNA酶降解。酶降解。B.B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达siRNAsiRNA。C.C.载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞用逆转录载体或慢病毒载体。用逆转录载体或慢病毒载体。256 6）体外导入细胞）体外导入细胞a.a.脂质体转染：脂质体转染：具体操作步骤：具体操作步骤：按照脂质体说明书进行按照脂质体说明书进行26b.b.电穿孔导入：电穿孔导入：27c.c.病毒感染（以腺病毒为例）：病毒感染（以腺病毒为例）：2829第二节第二节 反义核酸技术反义核酸技术3019781978年，年，Stephenson Stephenson 和和ZamecnikZamecnik首次报道了首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSVRSV的的复制现象。复制现象。1984 1984 年，年，IzantIzant weintraubweintraub提出了提出了“反义核反义核酸技术酸技术”的概念。的概念。Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide.Proc Natl Acad Sci USA,1978;75:285-288.历史由来31反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义列，包括反义DNADNA和反义和反义RNARNA。基本概念反义反义RNA技术技术反义反义DNA技术技术32反义抑制的主要机理直直接接作作用用于于靶靶mRNA的的SD序序列列或或部部分分编编码码区区，直直接接抑抑制制翻翻译译，或或与与靶靶mRNA结结合合形形成成双双链链RNA，从而易被从而易被RNA酶酶H降解。降解。反义反义核酸核酸mRNARNaseH33论著超过篇。论著超过篇。基因功能研究（基因功能研究（19941994年流行）年流行）如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。反义核酸应用反义核酸应用3419981998年年8 8月月2727日，美国食品药品管理局（日，美国食品药品管理局（FDAFDA）正）正式批准了由式批准了由ISISISIS公司开发的全球第一个反义药物公司开发的全球第一个反义药物“Vitravene”Vitravene”（福米韦生，（福米韦生，fomivirsenfomivirsen）在美）在美国上市。国上市。该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的10001000倍，用倍，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎细胞视网膜炎,有效率高达有效率高达80%-90%80%-90%。VitraveneVitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物为注射剂，患者每月只需注射一次药物（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为2525，用糖皮质，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。激素治疗可缓解或消除其炎性反应。2 2个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 35a.避免内源性核酸酶对其降解b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力Hdeoxyribose提高有效性提高有效性技术难点技术难点36第一代硫代修饰（第一代硫代修饰（Phosphorothioate）Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathwaysO37第二代修饰第二代修饰(2-O-methyl,2-O-methoxyethyl)Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways382001 2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症 Macugen 哌加他尼392003 2003 新一代抗新一代抗HIVHIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物新药，属于病毒的融合阻止剂类药物 Fuzeon 40Tysabri2004 2004 专治多发性硬化症专治多发性硬化症 4142第三节第三节 核酶技术核酶技术43核酶（核酶（ribozymeribozyme）ribonucleic acid enzyme ribonucleic acid enzyme 具具有有催催化化活活性性的的RNARNA，化化学学本本质质是是RNA,RNA,却却具具有酶的催化功能。有酶的催化功能。基本概念基本概念44切赫切赫()()（1947-1947-），美国人），美国人,他独他独立地发现发现四膜虫转录产物立地发现发现四膜虫转录产物rRNArRNA前体，可切除自身的前体，可切除自身的413413个个核苷酸的内含子，使两个外显核苷酸的内含子，使两个外显子拼接起来，变成成熟的子拼接起来，变成成熟的rRNArRNA分子。分子。历史由来历史由来ThomasR.Cech198245S.Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，留下RNA能够切割rRNA前体的5端。1983461989NobelPrizeinChemistry核酶的发现改变了核酶的发现改变了“所有酶都是蛋白质所有酶都是蛋白质”的传统观念的传统观念47有封闭有封闭切割切割RNARNA应用应用阻断基因的表达（1994年左右比较流行的研究工具）48通常由60个核苷酸左右组成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13个碱基。锤头状核酶结构示意图4950第四节第四节 基因敲除技术基因敲除技术时间：时间：8080年代末年代末功能：建立基因失活或缺失的动物模型功能：建立基因失活或缺失的动物模型51发展历史发展历史a.胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）分离培养）分离培养取自小鼠受精卵发育第取自小鼠受精卵发育第4，5天的胚胎细胞天的胚胎细胞 能在体外培养，保留发育的全能性能在体外培养，保留发育的全能性1981年年，马马丁丁埃埃文文斯斯(Martin JEvans)从从正正常常的的小小鼠鼠囊囊胚胚中中分分离离到到了了ES细细胞胞。小小鼠鼠ES细细胞胞的的分分离离和和应应用用是是ES细细胞胞技技术术发发展展的的里里程程碑。碑。52同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似相同或者相似DNADNA序列间的重组，通常通过一对同源分序列间的重组，通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。b.同源重组技术应用同源重组技术应用531985年年，奥奥利利弗弗史史密密塞塞斯斯(Oliver Smithies)等等首首次次报报道道在在肿肿瘤瘤细细胞胞中中实实现现了了人人工工打打靶靶载载体体和和内内源源-球蛋白基因间的同源重组。球蛋白基因间的同源重组。541988年年，卡卡佩佩基基安安德德等等发发展展了了一一种种称称为为“正正负负筛筛选选”的的策策略略，将将胸胸腺腺嘧嘧啶啶激激酶酶基基因因（tk）置置于于打打靶靶载载体体的的外外侧侧，作作为为筛筛选选的的负负性性标标记记。这这比比单单用用阳阳性性筛筛选选正正确确克克隆隆富富集集的的倍倍数数高高310倍倍，真真正正使使得同源重组技术得以应用。得同源重组技术得以应用。马里奥马里奥卡佩基安德卡佩基安德(Mario R(Mario RCapechiand)Capechiand)丙氧鸟苷丙氧鸟苷55Martin Evans马丁马丁埃文斯埃文斯Mario Capecchi马里奥马里奥卡佩基卡佩基Oliver Smithies奥利弗奥利弗史密斯史密斯56原理和操作流程原理和操作流程5758小结小结 1 1、RNAiRNAi技术：技术：基本概念；基本概念；RNAi RNAi技术发展历史；技术发展历史；RNAi RNAi机制；机制；RNAi RNAi设计。设计。2 2、反义核酸技术：、反义核酸技术：基本概念；基本概念；技术应用。技术应用。3 3、核酶技术：、核酶技术：核酶概念；核酶概念；核酶发展历史；核酶发展历史；核酶技术应用。核酶技术应用。4 4、基因敲除技术：、基因敲除技术：基因敲除技术的概念；基因敲除技术的概念；基因敲除技术的发展历史；基因敲除技术的发展历史；基因敲除技术的建立及技术流程。基因敲除技术的建立及技术流程。59感想感想1.意外=Key2.科研选题：follow or create?3.Pure scientist 60作业作业1.1.简述简述RNAiRNAi实验设计流程实验设计流程2.2.简述马里奥简述马里奥卡佩基安德卡佩基安德(Mario R(Mario RCapechiandCapechiand)的的“正负筛选正负筛选”的策略的策略6162