基因工程导论.ppt

C C 基因工程的理论基础基因工程的理论基础1 1 基因工程的基本概念基因工程的基本概念B B 基因工程的基本形式基因工程的基本形式A A 基本定义基本定义第十章第十章 基基 因因 工工 程程 导导 论论A A 基本定义基本定义1 1 基因工程的基本概念基因工程的基本概念 基因工程基因工程是指将一种生物体（是指将一种生物体（供体供体）的基因与）的基因与载体载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的性状的DNADNA体外操作程序，也称为体外操作程序，也称为分子克隆技术分子克隆技术。因此，因此，供体、受体、载体供体、受体、载体是基因工程的三大基本元是基因工程的三大基本元件。件。1 1 基因工程的基本概念基因工程的基本概念 广义的广义的基因工程基因工程是指重组是指重组DNADNA技术的产业化设计与技术的产业化设计与应用，包括应用，包括上游技术上游技术和和下游技术下游技术两大组成部分。两大组成部分。上游技上游技术术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNADNA技术）；而技术）；而下游技术下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程(gene engineering)常和以下名称混用:n遗传工程(genetic engineering);n基因克隆(gene cloning);n分子克隆(molecular cloning);n基因操作(gene manipulation);n重组DNA技术(rebination DNA technique)n克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.n作动词时是指基因的分离与重组过程。基因工程的操作过程基因工程的操作过程转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）重组重组DNADNA分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）DNADNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检B B 基因工程的基本形式基因工程的基本形式1 1 基因工程的基本概念基因工程的基本概念第一代基因工程第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程经典基因工程第二代基因工程第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程蛋白质工程第三代基因工程第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构代谢信息途径的修饰重构 途径工程途径工程 第四代基因工程第四代基因工程 基因组或染色体的转移基因组或染色体的转移 基因组工程基因组工程C C 重组重组DNADNA技术的理论基础技术的理论基础1919世纪中世纪中 孟德尔孟德尔 豌豆杂交试验豌豆杂交试验 遗传因子遗传因子 经典遗传学经典遗传学2020世纪初世纪初 摩尔根摩尔根 果蝇杂交实验果蝇杂交实验 基因基因 基因学基因学19441944年年 艾弗瑞艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验 遗传物质遗传物质DNADNA19731973年年 伯格伯格-杰克森杰克森-考恩考恩-鲍耶鲍耶 DNADNA分子体外拼接分子体外拼接分子遗传学分子遗传学19531953年年 沃森沃森-克瑞克克瑞克 DNADNA双螺旋结构双螺旋结构 分子生物学分子生物学基因工程基因工程2 2 基因工程的基本条件基因工程的基本条件C C 用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞B B 用于用于基因克隆的载体基因克隆的载体A A 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶A A 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶2 2 基因工程的基本条件基因工程的基本条件限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶核酸酶核酸酶核酸修饰酶核酸修饰酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链识别双链DNADNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNADNA双链双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNADNA的入侵的入侵细菌的限制与修饰作用细菌的限制与修饰作用hsd hsd RR：编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶hsd hsd MM：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd S S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达编码限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，SmithSmith等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出 Hind IIHind II和和Hind IIIHind III 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I I 型型 II II 型型 III III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP MgATP Mg2+2+SAM SAMATP MgATP Mg2+2+SAM SAMMgMg2+2+识别序列识别序列TGANTGAN88TGCTTGCT旋转对称序列旋转对称序列GAGCCGAGCCAACNAACN66GTGCGTGCCAGCAGCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列1 1kbkb处处识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割24-2624-26bpbp处处限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 株名株名H i n d IIIH i n d III H i nH i n d III d IIIH Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链识别双链DNADNA分子中分子中4-84-8对碱基的特定序列对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A G 33 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoR IEcoR I的识别序列的识别序列EcoR IEcoR I的切割位点的切割位点EcoRIEcoRI等产生的等产生的55粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-GG-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-GG-CC-T T-C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 5 GG-CC-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-GG AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA GG-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPPPstIPstI等产生的等产生的33粘性末端粘性末端5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-OHOH PP-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-PP OHOH-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPPPvuIIPvuII等产生的等产生的平头末端平头末端5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-C 5C 5PvuII 37 PvuII 37 5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-T T-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-T T-C 5 C 5 DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复双链修复双链DNADNA上切口处的磷酸二酯键上切口处的磷酸二酯键DNADNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPP5 5 GG-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-T T-CC-CC-T T-C 5C 5nicknicknicknickDNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上切口处的磷酸二酯键链上切口处的磷酸二酯键T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG AA-CC-GG-GG-CC-CC-T T-C 5C 5OHOHPPnicknick5 5 GG-CC-UU-CC-UU-GG-CC-CC-GG-GG-AA-GG 3 33 3 CC-GG-AA-GG-AA-CC-GG-GG-CC-CC-T T-C 5C 5ds-DNAds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HO P53HO P5DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：5 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC 5 55 5 GG-CC-T T-CC-AA-GG-OHOH PP-CC-T T-GG-GG-AA-GG 333 3 CC-GG-AA-GG-T T-CC-PP OHOH-GG-AA-CC-CC-T T-CC 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征载体的功能及特征载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNADNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的型的绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即即cccDNAcccDNA质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 1-300 kbkb质粒质粒质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：建的：pSC101pSC101 8.8 kb 8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcTcrrColE1ColE1 6.5 kb 6.5 kb 拷贝数拷贝数 20-30 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1E1RSF2124RSF2124 ColE1 ColE1衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 ApAprr质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR322：氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50-100/50-100/cellcell用于基因克隆用于基因克隆 质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18/19/19：拷贝数拷贝数 2000-3000/2000-3000/cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18/19/19：正选择标记正选择标记 lacZ lacZ 的显色原理的显色原理pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSbb-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的aa-肽段肽段a a a a a ab b b b b b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基吲哚基-bb-D-D-半乳糖半乳糖苷苷X-galX-gal噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：生物结构生物结构l l 噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA-DNA组组成成 l l-DNA-DNA全长全长4850248502个核苷个核苷酸酸l l-DNA-DNA上上至少有至少有6161个基因个基因l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：生物结构生物结构5 TCCAGCGGCGGGG5 TCCAGCGGCGGGG3333CCCGCCGCTGGA 5 CCCGCCGCTGGA 5 COSCOSCOSCOScoscos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l l l l-DNA-DNA噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：感染周期感染周期体内包装体内包装100100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原DNADNA的的75-105%75-105%即即 36-51 36-51 kbkbDDAA噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 野野生生型型l l-DNA-DNA包包装装的的上上限限为为5151kbkb，本本身身长长度度为为48.548.5kbkb，只只有有当当插插入入的的外外源源DNADNA片片段段不不大大于于2.52.5kbkb时时，才才能能被被包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。因因此此缩缩短短野野生生型型l l-DNA-DNA的的长长度度，可可以以提提高高装装载载量量。其其实实野野生生型型l l-DNA-DNA上上约约有有40-50%40-50%的的片片段段是是复复制制和和裂裂解解所非必需的。根据切除的多少，可将所非必需的。根据切除的多少，可将l l-DNA-DNA分成两大类载体：分成两大类载体：插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 插入型载体插入型载体体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段插入片段载体长度载体长度 37 37 kbkb插入片段大小：插入片段大小：0-14 0-14 kbkb（51 3751 37）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度 取代型载体取代型载体体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度 10 10 kbkb（51 2651 26）载体长度载体长度 26 26 kbkb插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度 25 25 kbkb（36 2636 26）噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的 l l 噬菌体噬菌体DNADNAl l-DNA-DNA重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：l l-DNA-DNA重重组组分分子子需需在在体体外外人人工工包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体重重组组颗颗粒，方可高效导入受体细胞粒，方可高效导入受体细胞用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白质质可可直直接接从从感感染染了了l l噬噬菌菌体体的的大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取，现现已已商商品品化化。这这些些包包装装蛋蛋白白通通常常分分为为相相互互互互补补的的两两部部分分：一一部部分分缺缺少少E E组组份份，另另一一部部分分则则缺缺少少DD组组份份。包包装装时时，当当且且仅仅当当这这两两部部分分包包装装蛋蛋白白与与重重组组l l-DNA-DNA分分子子混混合合后后，包包装装才才能能有有效效进进行行，任任何何一一种种蛋蛋白白包包装装液液被被重重组组l l-DNA-DNA污污染染后后，均均不不能能被被包包装装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的考斯质粒考斯质粒考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工构建的含有19781978年年CollinsCollins和和HohnHohn发明构建发明构建pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcrrll fragment fragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamHIBamHISalISalIl l-DNA-DNA coscos序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的特殊类型的载体特殊类型的载体coscos site-carrying plasmid site-carrying plasmid1.8 1.8 kbkb的的l l-DNA-DNA片段片段+pBR322pBR322片段片段装载范围为装载范围为31-45 31-45 kbkb考斯质粒考斯质粒考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像l l-DNA-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（45 45 kbkb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞人造染色体载体人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要克隆数百克隆数百甚至上千甚至上千 kb kb 的的DNADNA片段，片段，此时考斯质粒的装载量也远远不能此时考斯质粒的装载量也远远不能满足需要。满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源源DNADNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体（细菌人造染色体（BACBAC）酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC）人造染色体载体人造染色体载体酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建：酵母人造染色体的构建：pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的酵母系统的选择标记选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为350-400 350-400 kbkb人造染色体载体人造染色体载体酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）酵母人造染色体的使用：酵母人造染色体的使用：pYAC4pYAC4CENCENEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHIBamHITELTELorioriApAprrTRPTRPARSARSEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHI连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体C C 用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞3 3 基因工程的基本条件基因工程的基本条件各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（recBrecB-，recCrecC-，hsdRhsdR-）重组整合缺陷型重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recArecA-）具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体大肠杆菌大肠杆菌用于接受质粒：用于接受质粒：C600C600、W3110W3110、HB101HB101、JM83JM83、JM101JM101（ApApss、TcTcss、CmCmss）用于接受用于接受l l-DNA-DNA：LE392LE392、ED8654ED8654 酵母菌酵母菌哺乳动物细胞哺乳动物细胞 CHO CHO 毕赤酵母毕赤酵母啤酒酵母啤酒酵母3 3 基因工程的操作过程基因工程的操作过程C C 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）B B 重组重组DNADNA分子的转化和扩增（转、增）分子的转化和扩增（转、增）A DNAA DNA的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）3 3 基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检A DNAA DNA的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）3 3 基因工程的操作过程基因工程的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换粘性末端的更换人工粘性末端的连接人工粘性末端的连接重组率重组率同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGB B 重组重组DNADNA分子分子的转化和扩增（转与增）的转化和扩增（转与增）3 3 基因工程的操作过程基因工程的操作过程转化的原理与技术转化的原理与技术转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增转化的原理与技术转化的原理与技术CaCa2+2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 Ca Ca2+2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），大肠杆菌等），19701970年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是CaCa2+2+与细菌外与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态感受态 转化的原理与技术转化的原理与技术电穿孔转化电穿孔转化 将将待待转转化化的的质质粒粒或或DNADNA重重组组连连接接液液加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池池中中，两两极极施施加加高高压压电电场场。在在强强大大电电场场的的作作用用下下，细细菌菌细细胞胞壁壁和和细胞膜产生缝隙，质粒或细胞膜产生缝隙，质粒或DNADNA重组分子便可进入细胞内重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验C C 转化子的筛选和鉴定（检）转化子的筛选和鉴定（检）3 3 基因工程的操作过程基因工程的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分助各种筛选和鉴定方法区分转化子转化子与非转化子与非转化子、重组子重组子与非与非重组子、重组子、目的重组子目的重组子与非目的重组子与非目的重组子转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子载体遗传标记检测载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法的基本原理：pBR3224363 bpori抗药性筛选法可区分抗药性筛选法可区分转化子转化子与非与非转化子、转化子、重组子重组子与非重组子与非重组子将外源将外源DNADNA片段插在片段插在EcoRIEcoRI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcr r 将外源将外源DNADNA片段插在片段插在BamHIBamHI位点：位点：非重组子呈非重组子呈 ApAprr、TcTcr r 重组子呈重组子呈 ApAprr、TcTcs s 载体遗传标记检测载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有先将转化液涂布含有ApAp的平板的平板再将再将ApAp平板上的转化子影印至平板上的转化子影印至含有含有ApAp和和TcTc的平板上的平板上 在在ApAp平板上生长、但在平板上生长、但在ApAp和和TcTc平板上平板上不长的转化子即为不长的转化子即为 ApApAp+TcAp+Tc影印影印挑选挑选重组子重组子 载体遗传标记检测载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作：pUC18AprlacZoriAp+X-galAp+X-gal重组子（重组子（ApAprr+lacZ+lacZ-）将将外外源源基基因因克克隆隆在在pUC18pUC18的的lacZlacZ标标记记基基因因内内部部，使使之之灭灭活活，此此时时重重组组子子呈呈ApAprr、lacZlacZ-，淡淡黄黄色色菌菌落落；而而非非重组子则呈重组子则呈ApAprr、lacZlacZ+，蓝色菌落蓝色菌落 核酸分子杂交Southern杂交检测DNASouthernSouthern杂交检测杂交检测DNADNAA A 鸟枪法鸟枪法4 4 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组随机克隆供体细胞的全基因组DNADNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的众多克隆中分离出含有目的基因的目的目的重组子重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离用于原核细菌目的基因的克隆分离 B cDNAB cDNA法法4 4 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序cDNAcDNA法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mDNAmDNAc cDNADNA第一链的合成第一链的合成 55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 3355pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55cDNAcDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPsc cDNADNA第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸NaOHNaOH自身引导法：自身引导法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1S1c cDNADNA第二链的合成第二链的合成 DNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH置换合成法：置换合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555S1S1 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligasec cDNADNA第二链的合成第二链的合成 dCTPdCTPTdTTdT引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cDNA cDNA 能保留完整的能保留完整的55端序列端序列55pppppp55G G AAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTpp 5533 HOHO55pppppp55G G AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH 3333 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp 5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH 33NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPscDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略双链双链c cDNADNA的克隆的克隆 双链平头的双链平头的cDNAcDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，平头两端分别接同聚物尾，最好是最好是ATAT同聚物尾，这样重组同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和S1S1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，加装人工接头引