基础生物化学第3章.ppt

10 DNA10 DNA的生物合成的生物合成Chapter 10 DNA BiosynthesisChapter 10 DNA Biosynthesis，ReplicationReplication 本章重点与难点本章重点与难点重点：掌握中心法则；半保留复制、半不重点：掌握中心法则；半保留复制、半不连续复制、反转录、基因工程的概念；参连续复制、反转录、基因工程的概念；参与与DNADNA复制的有关酶类和蛋白复制过程；复制的有关酶类和蛋白复制过程；DNADNA损质及损质及DNADNA的伤修复的方式。的伤修复的方式。难点：对难点：对DNADNA的半保留复制、半不连续复的半保留复制、半不连续复制的理解。制的理解。遗传的中心法则 1958 1958年年年年CrickCrick提出以提出以提出以提出以DNADNA为中心的遗传信息的传递规律，为中心的遗传信息的传递规律，为中心的遗传信息的传递规律，为中心的遗传信息的传递规律，即即即即DNADNA贮存的遗传信息通过复制传给子代贮存的遗传信息通过复制传给子代贮存的遗传信息通过复制传给子代贮存的遗传信息通过复制传给子代DNADNA，通过转录，通过转录，通过转录，通过转录传给传给传给传给RNARNA，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为这个规律被称为这个规律被称为这个规律被称为中心法则中心法则中心法则中心法则。DNADNARNARNA蛋白质蛋白质复制复制复制复制转录转录翻译翻译反转录反转录19701970年年年年TeminTemin和和和和BaltimoreBaltimore发现发现发现发现RNARNA病毒的病毒的病毒的病毒的RNARNA可通过反转录可通过反转录可通过反转录可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给（逆转录）将遗传信息传给（逆转录）将遗传信息传给（逆转录）将遗传信息传给cDNAcDNA，也可通过，也可通过，也可通过，也可通过RNARNA复制或复制或复制或复制或RNARNA转录传给子代转录传给子代转录传给子代转录传给子代RNARNA，这是对中心法则的补充。，这是对中心法则的补充。，这是对中心法则的补充。，这是对中心法则的补充。19971997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向信息向信息向信息向DNADNA传递。传递。传递。传递。？复制（复制（DDDPDDDP）转录（转录（DDRPDDRP）翻译翻译 DNA mRNA DNA mRNA 蛋白质蛋白质 反转录（反转录（RDDPRDDP）RNA RNA 复制（复制（RDRPRDRP）n nDNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。n n生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以亲代（母链）是指遗传物质的传代，以亲代（母链）DNA为模板合成子链为模板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA一、一、DNADNA复制的基本规律复制的基本规律（一般原理）（一般原理）Basic Rules of DNA Replication l复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)l复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity)l双向复制双向复制(bidirectional replication)l半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication)（一）（一）DNA复制是半保留复制复制是半保留复制(semi-conservative replication)DNA生生物物合合成成时时，母母链链DNA解解开开为为两两股股单单链链，各各自自作作为为模模板板(template)按按碱碱基基配配对对规规律律，合合成成与与模模板板互互补补的的子子链链。子子代代细细胞胞的的DNA，一一股股单单链链从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来，另另一一股股单单链链则则完完全全从从新新合合成成。两两个个子子细细胞胞的的DNA都都和和亲亲代代DNA碱碱基基序序列列一一致致。这这种种复复制制方式称为方式称为半保留复制半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA 子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式（散布式）混合式（散布式）lDNADNA以以半半保保留留方方式式进进行行复复制制，是是在在19581958年年由由M.M.Meselson Meselson 和和 F.F.Stahl Stahl 所所完完成成的的密密度度飘飘移移实实验验所所证证明明。该该实实验验首首先先将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含1515N N的的培培养养基基中中培培养养约约十十五五代代，使使其其DNADNA中中的的碱碱基基氮氮均均转转变变为为1515N N。将将大大肠肠杆杆菌菌移移至至只只含含1414N N的的培培养养基基中中同同步步培培养养一一代代、二二代代、三三代代。分分别别提提取取DNADNA，作作密密度度梯梯度度离心，可得到下列结果：离心，可得到下列结果：密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果按按半半保保留留复复制制方方式式，子子代代DNA与与亲亲代代DNA A的的碱碱基基序序列列一一致致，即即子子代代保保留留了了亲亲代代的的全全部部遗遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从原点从原点(起始点，起始点，origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为相反的复制叉，称为双向复制双向复制。（二）（二）DNA复制是固定起点的双向复复制是固定起点的双向复制制复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象A.环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B.复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C.复制接近终止点复制接近终止点(termination,ter)oriterA B C真核生物每个染色体有多个复制原真核生物每个染色体有多个复制原点，是多复制子的复制。点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻复制原点之间的习惯上把两个相邻复制原点之间的距离定为一个距离定为一个复制子复制子(replicon)。复制。复制子是能够独立完成复制的功能单位。子是能够独立完成复制的功能单位。53oriorioriori535533553复制子复制子3（三）（三）DNA复制是半不连续复制复制是半不连续复制3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)顺顺着着解解链链方方向向生生成成的的子子链链，复复制制是是连连续续进进行行的的，这这股链称为股链称为先导链先导链或或领头链领头链。另另一一股股链链因因为为复复制制的的方方向向与与解解链链方方向向相相反反，不不能能顺顺着着解解链链方方向向连连续续延延长长，这这股股不不连连续续复复制制的的链链称称为为随随后后链链或或随随从从链链。复复制制中中的的不不连连续续片片段段（约约1000个个核核苷酸）称为苷酸）称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment，1968)。先先导导链链连连续续复复制制而而随随后后链链不不连连续续复复制制，称称为为半半不不连连续复制或复制的续复制或复制的半不连续性半不连续性。n n由由于于亲亲代代DNADNA双双链链在在复复制制时时是是逐逐步步解解开开的的，因因此此，随随从从链链的的合合成成也也是是一一段段一一段段的的。DNADNA在在复复制制时时，由由随随从从链链所所形形成成的的一一些些子子代代DNADNA短短 链链 称称 为为 冈冈 崎崎 片片 段段(Okazaki fragment)(Okazaki fragment)。n n冈冈崎崎片片段段的的大大小小，在在原原核核生生物物中中约约为为1000100020002000个个核核苷苷酸酸，而而在在真真核核生生物物中中约为约为100100个核苷酸。个核苷酸。（四）需要引物n n参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。n nRNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。二、二、DNA复制的酶学复制的酶学（DNADNA复制相关的酶和蛋白质）复制相关的酶和蛋白质）The Enzymology of DNA Replication参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶聚合酶(polymerase):依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DDDP或或DNA-pol模板模板(template):解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer):提供提供3-OH末端使末端使dNTP可以依次聚可以依次聚合合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子（一）复制的化学反应（一）复制的化学反应 (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi 目目 录录聚合反应的特点聚合反应的特点DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板 DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行方向进行（模板方向为（模板方向为 3 5 ，合成方向为，合成方向为5 3 。）。）（二）（二）DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1.53 的聚合活性的聚合活性2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性核酸外切酶活性 1 1、原核生物的、原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 催化催化DNA聚合聚合参与参与DNA损损伤的应急状态伤的应急状态修复修复修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数+-+5 外切酶活性外切酶活性+5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE.Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。DNA-pol（120kD）DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。功能：功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-pol ：由十种亚基组成，其中：由十种亚基组成，其中亚基具有亚基具有5353聚合聚合DNADNA的酶活性，因而具有复制的酶活性，因而具有复制DNADNA的功能；而的功能；而亚基具有亚基具有3535外切酶的活性，因而与外切酶的活性，因而与DNADNA复制的校复制的校正功能有关。正功能有关。(250kD)2 2、真核生物的、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶l在真核生物中，目前发现的在真核生物中，目前发现的DNADNA聚合酶有五种，聚合酶有五种，分别命名为分别命名为DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol），），DNADNA聚合聚合酶酶（pol pol），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol）。）。l其中，参与染色体其中，参与染色体DNADNA复制的是复制的是pol pol（延长（延长随从链）和随从链）和pol pol（延长领头链），参与线粒（延长领头链），参与线粒体体DNADNA复制的是复制的是pol pol，polpol与与DNADNA损伤修复、损伤修复、校读和填补缺口有关，校读和填补缺口有关，pol pol 只在其他聚合酶只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。无活性时才发挥作用。（三）复制保真性的酶学依据（三）复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 复制的保真性和碱基选择复制的保真性和碱基选择1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。不表现活性。2 2、复制的保真性和碱基选择、复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制（四）复制中的分子解链及（四）复制中的分子解链及DNA 分分子拓扑学变化子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。1、解螺旋酶、引物酶和单链、解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白E.Coli 基因图基因图目目 录录解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条单链解开成为两条单链引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整链的完整 l解螺旋酶解螺旋酶（unwinding enzyme），又称，又称解链酶或解链酶或rep蛋白，蛋白，是用于解开是用于解开DNA双双链的酶蛋白，每解链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消开一对碱基，需消耗两分子耗两分子ATP。目。目前发现存在至少存前发现存在至少存在两种解螺旋酶。在两种解螺旋酶。单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白n n单单链链DNADNA结结合合蛋蛋白白（single single strand strand binding binding protein,protein,SSBSSB）又又称称螺螺旋旋反反稳稳蛋蛋白白（HDPHDP）。这这是是一一些些能能够够与与单单链链DNADNA结结合合的的蛋蛋白白质质因因子子。其其作作用用为为：使使解解开开双双螺螺旋旋后后的的DNADNA单单链链能能够够稳稳定定存存在在，即即稳稳定定单单链链DNADNA，便便于于以以其其为为模模板板复复制制子子代代DNADNA；保保护护单单链链DNADNA，避避免免核核酸酸酶酶的降解。的降解。l引发体引发体(primosome)(primosome)由引发前体与引物酶由引发前体与引物酶（primaseprimase）组装而成。）组装而成。l引物酶本质上是一种依赖引物酶本质上是一种依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶（DDRPDDRP），该酶以），该酶以DNADNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNARNA短链引短链引物物(primer)(primer)，以提供自由的，以提供自由的3-OH3-OH，使子代，使子代DNADNA链能链能够开始聚合。够开始聚合。1010 8 8 局部解链后局部解链后2、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase)解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目目 录录拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能供能，连接断端，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。作用机制作用机制 目目 录录（五）（五）DNA连接酶连接酶连连接接DNA链链3-OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5-P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相邻的相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式HO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353n nDNADNA连连接接酶酶催催化化的的条条件件是是：需需一一段段DNADNA片片段段具具有有3-OH3-OH，而而另另一一段段DNADNA片片段段具具有有5-Pi5-Pi基基；未未封封闭闭的的缺缺口口位位于于双双链链DNADNA中中，即即其其中中有有一一条条链链是是完完整整的的；需需要要消消耗耗能能量量，在在原原核核生生物物中中由由NADNAD+供供能能，在在真真核核生生物物中中由由ATPATP供供能。能。DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能三、三、DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication1 1、复制的起始、复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1）DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2）合成引物，提供）合成引物，提供3-OH末端。末端。（一）原核生物的（一）原核生物的DNA生物合成生物合成 E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 a.DNA解链解链 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 b.引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶复制的起始DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。预引发：1解旋解链，形成复制叉：n由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。nDNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。2引发体组装：n由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。引发：n在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。2 2、复制的延长、复制的延长复复制制的的延延长长指指在在DNA-pol催催化化下下，dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加加入入引引物物或或延延长长中中的的子子链链上上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。聚合子代DNA：n由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶(延长随从链)和（延长领头链）。引发体移动：n引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV405003 3、复制的终止、复制的终止5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接去除引物，填补缺口：n在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。连接冈崎片段：n在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM（二）真核生物的（二）真核生物的DNA生物合成生物合成 细细胞胞能能否否分分裂裂，决决定定于于进进入入S期期及及M期期这这两两个个关关键键点点。G1S及及G2M的的调调节节，与与蛋蛋白白激激酶酶活活性有关。性有关。蛋蛋白白激激酶酶通通过过磷磷酸酸化化激激活活或或抑抑制制各各种种复复制制因因子子而而实施调控作用。实施调控作用。真真核核生生物物每每个个染染色色体体有有多多个个起起始始点点，是是多多复复制制子子复复制制。复复制制有有时时序序性性，即即复复制制子子以以分组方式激活而不是同步起动。分组方式激活而不是同步起动。复复制制的的起起始始需需要要DNA-pol（引引物物酶酶活活性性）和和pol（解解螺螺旋旋酶酶活活性性）参参与与。还还需需拓拓扑扑酶酶和复制因子和复制因子(replication factor,RF)。1 1、复制的起始、复制的起始3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体2 2、复制的延长、复制的延长染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。3 3、复制的终止、复制的终止5 3 3 5 5 3 3 5+5 3 3 3 3 5 5 切除引物的两种机制切除引物的两种机制端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、C碱基碱基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)组成组成端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工四、逆转录和其他复制方式四、逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录逆转录(reverse transcription)逆转录逆转录酶酶（一）逆转录病毒和逆转录酶（一）逆转录病毒和逆转录酶 反转录（reversetranscription）：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。1970年，Temin和Baltimore分别从致癌RNA病毒（劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中发现发反转录酶。致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。放线菌素D（抑制以DNA为模板的反应，复制和转录）能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。Bader用嘌呤霉素（puromycin）来抑制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（RSV），证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的，而不是感染后在宿主细胞中新合成的。反转录酶反转录酶由一个亚基和一个亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。（1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNADNA杂种分子）。（2）RNaseH酶活力，水解RNADNA杂种分子中的RNA，可沿35和53两个方向起外切酶作用。（3）DNA指导的DNA聚合酶活力。模板：模板：RNA或或DNA以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。引物：引物：RNA或或DNA底物：底物：dNTP二价阳离子：二价阳离子：Mg2+或Mn2+真核mRNA3端有polyA，加入oligodT后，可以作为反转录酶的模板，合成cDNA。逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA（二）逆转录研究的意义（二）逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。滚环复制滚环复制(rolling circle replication)（三）滚环复制和（三）滚环复制和D环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loop replication)是线粒体是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。五、五、DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)and Repair遗传物质的结构改变而引起的遗传信息遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为改变，均可称为突变。突变。在复制过程中发生的在复制过程中发生的DNA突变称为突变称为DNA损伤损伤(DNA damage)。一一些些物物理理化化学学因因子子如如紫紫外外线线、电电离离辐辐射射和和化化学学诱诱变变剂剂均均可可引引起起DNA损损伤伤，破破坏坏其其结结构构与与功功能能。然然而而在在一一定定条条件件下下，生生物物机机体体能能使这种损伤得到修复。使这种损伤得到修复。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上分子上碱基的改变。碱基的改变。（一）突变的意义（一）突变的意义1 1、突变是进化、分化的分子基础、突变是进化、分化的分子基础2 2、突变导致基因型改变、突变导致基因型改变3 3、突变导致死亡、突变导致死亡4 4、突变是某些疾病的发病基础、突变是某些疾病的发病基础 （二）引发突变的因素（二）引发突变的因素物理因素物理因素 紫外线紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射、各种辐射 UV化学因素化学因素（三）突变的分子改变类型（三）突变的分子改变类型错配错配(mismatch)缺失缺失(deletion)插入插入(insertion)重排重排(rearrangement)框移框移(frame-shift)DNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1）转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。2)颠换颠换1 1、错配、错配镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb(HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因2 2、缺失、缺失、插入插入和框移和框移缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上大分子上消失。消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到到DNA大分子中间。大分子中间。框移突变框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变。谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突变缺失引起框移突变3 3、重排、重排DNA分子内较大片段的交换，称为分子内较大片段的交换，称为重组或重排。重组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型（四）（四）DNA损伤的修复损伤的修复修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。回复为原有的天然状态。光修复光修复(light repairing)切除修复切除修复(excision repairing)重组修复重组修复(recombination repairing)SOS修复修复 修复的主要类型修复的主要类型1 1、光修复、光修复光修复酶光修复酶(photolyase)UVUvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHP2 2、切除修复、切除修复是细胞内最重要和是细胞内最重要和有效的修复机制，主要有效的修复机制，主要由由DNA-pol和连接酶和连接酶完成。包括切补切完成。包括切补切封四个步骤。封四个步骤。DNA连接酶连接酶ATPE.coli的切除的切除修复机制修复机制3 3、重组修复、重组修复切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。重组修复至少需要4种酶组分。重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。4 4、SOS修复修复当当DNA损损伤伤广广泛泛难难以以继继续续复复制制时时，由由此此而而诱诱发出一