(2.8.1)--1.8ELISA检测的基本原理和方法-CP4-EPSPS蛋白抗体.pdf

生物三程y b l 4 1，o 1 4，2 0 2 0C P 4 一E P S P S 蛋白抗体的制备及其夹心E L I S A 定量检测方法的建立候吉超，李忠鹏2，李小字2，张春雨2，于寒松小，王永志孙(1 吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春1 3 0 1 1 8；2 吉林省农业科学院，吉林长春1 3 6 1 0 0)摘要：为了快速高效地检测转c p 4e p s p s 基因抗除草剂大豆，本研究利用已制备的c P 4 一E P s P s 蛋白免疫实验动物，获得5 株c P 4 一E P S P S 蛋白鼠单克隆抗体及3 份羊抗血清，建立了c P 4 一E P s P s 蛋白双抗夹心酶联免疫吸附(e n z y m el i n k e di m m n o s o r b e n ta s s a y，E L I s A)检测方法，同时利用该方法对结荚期的c p 4e p s p s 转基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子进行定量检测。结果显示，最佳检测条件为捕获抗体1 D 1 2，工作浓度1 2 5 m L，包被酶标板，4 静置过夜，检测样品2 0 孵育4 5m i n，检测抗体8 0 9 2，工作浓度2 5 m L，2 0 孵育3 0m i n；c P 4 一E P s P s 蛋白在模拟大豆环境中最低检测限为3 6n m L，检测范围为7 5 1 2 5n m L；重复性变异系数小于1 5。利用上述检测条件，在转C p 4e p s p s基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子中均检测到c P 4 一E P S P S 蛋白的表达，且各组织部位表达量差异显著，其中c P 4 一E P s P s 蛋白在叶片中表达量最高，茎、种子、根中c P 4 一E P s P s 蛋白表达量逐渐降低。关键词：C P 4 一E P S P S，酶联免疫吸附(E L I S A)，大豆，抗体，检测P r e p a r a t i o no fA n t i b o d i e sa g a i n s tC P 4 一E P S P Sa n dE s t a b l i s h m e n to fI t sQ u a n t i t a t i V eD A S E L I S AH o UJ i c h a 0 1 _，L IZ h o n g p e n 9 2，L IX i a o y u 2，Z H A N GC h u n y u 2，Y UH a n s o n 9 1，W A N GY o n g z I l i 2+(1 C o l l e g eo fF o o dS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g，J i l i nA g r i c u l t u r a Ju n i v e r s i t y，C h a n g c h u n1 3 0 1 1 8，C h i n a；2 J i l i nA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s，C h a n g c h u n1 3 6 1 0 0，C h i n a)A b s t m c t：T or 印i d l ya n de f f i c i e n t l yd e t e c tC p 4e p s p st r a n s g e n i ch e r b i c i d e t o l e r a n ts o y b e a n s，5s t r a i n so fm o u s ea n t i C P 4 一E P S P Sp m t e i nm o n o c l o n a la n t i b o d i e sa n d3s h e e pa n t i C P 4 一E P S P Sp r o t e i ns e m mw e r eo b t a i n e db yi m m u n i z i n ge x p e r i m e n t a la n i m a l sw i t hC P 4 一E P S P Sp r o t e i n Ad o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c hE U S Af o rd e t e c t i n gC P 4 一E P S P Sp r o t e i nw a se s t a b l i s h e d，w h i c hc o u l da l s oq u a n t i f yC P 4 一E P S P Sp r o t e i ni nd i f k r e n tt i s s u e sf r o mC p 4e p s p st r a n s g e n i ch e r b i c i d e t 0 1 e r a n ts o y b e a n sa tp o d s e t t i n gs t a g e T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a ld e t e c t i o nc o n d i t i o n s：T h ec a p t u r ea n t i b o d yw a s1I)1 2，w o r kc o n c e n t r a t i o nw a s1 2 5 斗g m L，c o a t e dw i t ht h eE u S Ap l a t e，a n ds t a n do v e r n i g h ta t4 T h et e s ts a m p l ew a si n c u b a t e da t2 0 f o r4 5m i n，t h ed e t e c t i o na n t i b o d yw a s8 0 9 2，w o r kc o n c e n t r a t i o nw a s2 5 斗m L，i n c u b a t e da t2 0 f o r3 0m i n T h em i n i m u md e t e c t i o nl i m“o fC P 4 一E P S P Sp m t e i ni ns i m u l a t e ds o y b e a ne n v i r o n m e n tw a s3 6n m L，t h ed e t e c t i o nr a n g ew a s7 5 1 2 5n m L，a n dt h er e p e a t a b i l i t yc o e f f i c i e n to fv 撕a t i o nw a sl e s st h a J l1 5 U n d e r t h ea b o v ed e t e c t i o nc o n d i t i o n s，t h ee x p r e s s i o no fC P 4 一E P S P Sp I D t e i nw a sd e t e c t e di nt h er o o t s，s t e m s，l e a v e sa n ds e e d so ft h eC p 4t r a n s g e n i ce p s p s r e s i s t a n ts o y b e a n，a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fv a r i o u st i s s u e sw e r ed i f k r e n t T h ee x p r e s s i o no fC P 4 一E P S P Sp m t e i nw a st h eh i g h e s ti nl e a v e s，b u td e c r e a s e dg m d u a l l yi ns t e m，s e e da n dm o t，w h i c hw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti nl e a v e s K e yw o r d s：C P 4 一E P S P S；E L I S A；s o y b e a n；a n t i b o d y；d e t e c t i o n中图分类号：r I S 2 0 1 2文献标识码：A文章编号：1 0 0 2 0 3 0 6(2 0 2 0)1 4 0 0 6 9 0 6d o i：1 0 1 3 3 8 6“i s s n l 0 0 2 0 3 0 6 2 0 2 0 1 4 0 1 2引文格式：候吉超，李忠鹏，李小宇，等c P 4 一E P s P s 蛋白抗体的制备及其夹心E L I s A 定量检测方法的建立 J 食品工业科技，2 0 2 0，4 1(1 4)：6 9 7 4 收稿日期：2 0 1 9 一0 9 2 7作者简介：候吉超(1 9 9 3 一)，男，硕士研究生，研究方向：食品生化与功能性食品，E m a i l：1 8 6 9 3 6 1 1 7 5 8 1 6 3 c o m。通讯作者：于寒松(1 9 7 9 一)，男，博士，教授，研究方向：豆制品加工，E m a i l：y 1 J h a n s o n g j l a u e d u c n。王永志(1 9 7 8 一)，男，博士，副研究员，研究方向：生物化学与分子生物学，E m a i l：y z w a n g 1 2 6 c o m。基金项目：吉林省农业科技创新工程自由创新项目(c x G c 2 0 1 7 z Y 0 3 5)：抗除草剂基因编码蛋白B a r P A T 检测试纸条的研制；吉林省省级产业创新专项资金项目(2 0 1 7 c 0 5 7 1)：转基因农产品检测试剂原料及检测产品的研发；吉林省科技厅重点研发项目(2 0 1 8 0 2 0 1 0 8 4 s F)：转基因农产品快速检测试剂的研发与应用；国家大豆产业技术体系(c A R s 一0 4 一P s 2 4)。万方数据坐巢竺焉=丙-磊一生物三程&锄卯册d 死砌咒。抛ye 厂而o d 觑如J 缈一”“一1 转基因作物与传统作物相比，具有抗逆性强、产量高等特点，为解决当前世界“粮食危机”作出了贡献。1。2 1；草甘膦(g l y p h o s a t e)又称农达，是一种低毒广谱除草剂。3o。从土壤农杆菌株c P 4 中分离得到抗草甘膦基因E p s p s，其编码的c P 4 一E P s P s 蛋白对草甘膦具有高抗性而被广泛应用于转基因大豆，使大豆过量表达E P s P s 蛋白，赋予大豆草甘膦抗性。4。5 1。目前，转C p 4e p s p s 基因抗除草剂大豆是世界上种植面积最大的转基因作物怕一，我国是世界上最大的大豆进口国，每年都要从美国、巴西、阿根廷等国进口大量的转基因大豆一一。随着转基因作物种类的增加及其产品的大规模商业化，使得人们对转基因农产品的安全性产生一定的质疑。8o，监管部门、企事业单位、科研单位和消费者对转基因检测产品提出更高的要求。因此，建立一种快速转基因大豆及其产品的鉴定方法是十分必要的6“o。我国目前对转C p 4e p s p s 基因大豆的检测技术主要分为两大类，基于外源核酸成分和外源蛋白靶标的检测技术。目前，检测效果最直观的是对基因编码的外源蛋白进行检测。9。1。酶联免疫吸附试验(e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y，E L I S A)是基于外源蛋白检测的常规检测方法，它具有操作简便、重复性好、特异性强、灵敏度高、耗时短、成本低等特点。1 3。”o。由于该方法对检测环境、操作方法等要求低，所以适合基层广泛推广应用7。”-。本研究利用表达纯化的c P 4 一E P s P s 可溶性蛋白免疫B A L B c 小鼠和绵羊，制备鼠单克隆抗体和羊多克隆抗体，并建立c P 4 一E P s P s 蛋白双抗夹心E L I s A 检测方法。通过对该方法工作条件的优化，提高该检测方法的准确性及灵敏度，以期为C P 4 一E P S P S 蛋白定量检测试剂盒的开发提供一定基础。1 材料与方法1 1 材料与仪器P A T 蛋白、C p 4e p s p s 工程表达菌株本实验室保存；6 8 周龄B A L B c 小鼠辽宁省实验动物资源中心；C p 4e p s p s 转基因大豆、非转基因大豆吉林省农业科学院农业生物技术研究所；弗氏佐剂、辣根过氧化物酶(H R P)标记兔抗小鼠I g G 和兔抗绵羊I g GS i g m a 公司；脱脂奶粉、硫酸卡那霉素生工生物工程(上海)股份有限公司；N i N T A 一琼脂糖亲和层析柱上海意弘生物科技有限公司；抗体亲和介质P r o t e i nGs e p h a r o s e4 F a s tF l o w上海羽朵生物科技有限公司；双组分T M B 显色液、D A B 显色试剂盒、B C A 蛋白定量试剂盒北京索莱宝科技有限公司。c O：恒温培养箱日本三洋公司；E L x 8 0 0 酶标仪美国B 1 0 一R A D 仪器有限公司。1 2 实验方法1 2 1C P 4 一E P S P S 蛋白纯化复苏实验室保存的c p 4e p s p s 表达菌，用L B 液体培养基(含终浓度为5 0n g m L 的硫酸卡那霉素)3 7 振荡培养至0 D。值达到O 6，加入终浓度为1m m o L L 的I P T G，摇床1 8 0r m i n，3 7 诱导4h；诱导后菌体用P B s 重悬3次，超声波破碎菌悬液，1 2 0 0 0r m i n 离心2 0m i n，取上清经N i N T A 一琼脂糖亲和层析柱纯化后获得可溶性c P 4 一E P s P s 蛋白旧，s D s P A G E 分析蛋白纯化效果。2 0o，B c A 蛋白试剂盒对其定量。1 2 2c P 4 一E P s P s 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备参照文献 2 0 的标准程序进行。将纯化的c P 4 一E P s P s 蛋白与弗氏佐剂混合，以1 0 0 g 只经肌肉注射免疫B A L B c 小鼠，两周免疫1 次，免疫3 次，在细胞融合前3d 加强免疫1 次，2 0 0 斗g 只。以重组蛋白C P 4 一E P S P S 和转C p 4e p s p s 基因大豆叶片粗提物为抗原，筛选c P 4 一E P s P s 特异性单克隆抗体。P r o t e i nG 柱纯化制备的单抗。2“，s D s P A G E 分析抗体纯化效果瞄o，B c A 蛋白试剂盒对其定量。1 2 3c P 4 一E P s P s 多克隆抗体的制备将纯化后的可溶性c P 4 一E P s P s 蛋白与弗氏佐剂混合肌肉多点注射免疫3 只绵羊，两周免疫一次，2m g 只。免疫3次后颈静脉采血，4，4 0 0 0r m i n 离心3 0m i n，分离血清旧o。P r o t e i nG 柱纯化羊抗血清，s D s P A G E 分析抗体纯度，B c A 蛋白试剂盒测定纯化后抗体浓度。1 2 4w e s t e mb l o t 分析抗体特异性纯化的c P 4 一E P S P S 蛋白经S D S P A G E 电泳后转印至P V D F 膜上，以制备的鼠单抗和羊多抗为一抗(1：5 0 0 0 稀释)，H R P 标记的兔抗小鼠I g G 和兔抗绵羊I g G 为二抗(1：1 0 0 0 0 稀释)，对抗体的特异性进行w e s t e mb l o t分析。1 2 5双抗夹心E L I s A 方法的建立将制备的单抗包被9 6 孔酶标板，1 0 0 L 孔，4 静置过夜；加入5 脱脂奶2 5 0 L 孔，3 7 封闭3 0m i n；加待测抗原1 0 0 工孔，2 0，静置孵育1h；加检测抗体1 0 0 工孔，2 0，静置孵育1h，以上每一步操作结束后P B s T 洗涤3 遍；T M B 显色液9 0 L 孔，避光显色3 0m i n；2m o L LH：s 0。溶液4 5 I 孔，终止反应；酶标仪测定o D。，。处吸光度值。根据公式：o D。，。待测抗原(P 值)o D。阴性抗原(N 值)2 1 判定检测结果为阳性。以上实验重复3 次，同时设置阳性、阴性、空白(阳性为C P 4 一E P S P S 蛋白；阴性为P A T 蛋白；空白为去离子水)3 个对照。1 2 6 双抗夹心E L I s A 工作条件的优化检测抗体的筛选：采用间接E u S A 对制备的3 份C P 4 一E P S P S蛋白羊抗血清进行效价检测，以免疫前羊血清为阴性血清，包被1 g m Lc P 4 一E P s P s 蛋白，一抗为倍比稀释的羊血清，二抗为H R P 标记的兔抗绵羊I g G，选择效价最高的羊多抗血清为检测抗体，并由南京钟鼎生物技术有限公司进行H R P 标记。捕获抗体的筛选：运用双抗夹心E L I s A 方法对5株单克隆抗体进行筛选，以制备的5 株c P 4 一E P s P s单克隆抗体分别为作为捕获抗体，包被9 6 孔酶标板，H R P 标记的多抗为检测抗体，待测抗原2 0 静置孵育1 5m i n，选择P N 最大值对应的单抗为捕获抗体。抗体工作浓度优化：通过矩阵滴定法。2 叫确定捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度。抗原、抗体孵育条件优化：运用双抗夹心E L I s A 方法分别优化捕获抗体、抗原及检测抗体的孵育条件，以P N 最大值万方数据生物三程瓦丽面矿型盟确定最佳孵育条件旧3。1 2 7双抗夹心E L I S A 灵敏度的测定将非转基因叶片用1 0 倍体积P B s 缓冲液研磨(1g 样品=1m LP B s)，1 2 0 0 0r m i n 离心5m i n，取上清液将c P 4 一E P s P s 蛋白从1 0 斗g m L 倍比稀释至3 9 0 6n g m L，运用优化后的双抗夹心E L I S A 方法进行检测。以倍比稀释的c P 4 一E P s P s 蛋白建立标准曲线。参考文献 2 5 中E u s A 方法考核，检测2 0 份阴性并计算其o D 4 5 0 平均值(x)和标准差(s D)，将+3 s D 代人标准曲线方程计算出对应的蛋白浓度，即为该方法的最低检测限。1 2 8 重复性试验分别采集4 份转C p 4e p s p s 基因大豆叶片和籽粒，用1 0 倍体积P B s 缓冲液研磨，1 2 0 0 0r m i n 离心5m i n，取上清，运用建立的双抗夹心E L I s A 方法检测，每份材料3 个平行，根据P N 值计算出板内、板问标准差及其变异系数o。1 2 9检测转C p 4e p s p s 基因抗除草剂大豆采集转c p 4e p s p s 基因大豆结荚期的根、茎、叶、种子各1 0份，每个样品3 个重复，用1 0 倍体积P B S 缓冲液研磨，1 2 0 0 0r m i n 离心5m i n，取上清，运用建立的双抗夹心E L I S A 方法检测C P 4 一E P S P S 蛋白表达量。1 3 数据处理使用E x c e l2 0 1 0 对原始数据进行初步分析并绘制相关图形。显著性差异分析采用S P S S2 3 0 软件。2 结果与分析2 1C P 4 一E P S P S 蛋白的S D S P A G E 分析利用N i N T A 一琼脂糖亲和层析柱对可溶性表达的C P 4 一E P S P S 蛋白进行纯化，如图1 所示，在4 9k D a处有清晰的蛋白条带。硒匝圄阻图lc P 4 一E P s P s 蛋白的s D s P A G E 分析F i g 1S D S P A G Ea n a l y s i so fC P 4 一E P S P Sp r o t e i n注：M：M a r k e r；1 4：N i N a t i v e 一1 0 0 缓冲液依次洗脱下的4 管c P 4 一E P s P s 蛋白。2 2C P 4 一E P S P S 蛋白抗体特异性分析本研究共制备了5 株单抗，分别为1 D 1 0、2 D 3、l D l O2 D 36 A 61 0 H 4m aM 阴阳阴广6 A 6、1 0 H 4、1 D 1 2，3 份多抗分别为8 0 9 2、7 0 4 0、7 0 3 8。如图2 所示，抗体经P m t e i nG 柱纯化，s D s P A G E 显示有两条带，分别为免疫球蛋白G(I g G)的轻链(2 5k D a)和重链(5 0k D a)。由w e s t e mb l o t 分析(如图3)，5 株单抗和3 份多抗均能特异性识别c P 4 一E P S P S 蛋白。k D aMl D l O2 D 36 A 61 0 H 4l D l 27 25 54 33 42 61 7k D a7 25 54 33 42 61 7M7 0 3 87 0 4 0 88 0 9 2蒡二一一严：-_L l一一图2抗c P 4 一E P s P s 抗体纯化的s D s P A G E 分析F i g 2S D S P A G Ea n a l y s i so fp u r i f i c a t i o no fa n t i C P 4 一E P S P Sa n t i b o d y注：M：M a r k e r；1 D 1 0、2 D 3、6 A 6、1 0 H 4、l D l 2：单抗；7 0 3 8、7 0 4 0、8 0 9 2：多抗。2 3C P 4 一E P S P S 蛋白双抗夹心EL I S A 检测方法的建立对3 份羊多抗血清效价进行测定，如图4 所示，3只羊中，8 0 9 2 效价最高，效价为1 2 8 0 0 0，因此，确定其为检测抗体。运用双抗夹心E L I s A 筛选捕获抗体，如表1 所示，5 株单克隆抗体中M A b1 D 1 2P N 值最大，表明M A b1 D 1 2 与多抗8 0 9 2 配对效果最佳，确定1D 1 2 为捕获抗体。采用矩阵滴定法筛选抗体的工作浓度，如表2 所示，选择捕获抗体工作浓度为1 2 5 斗g m L，检测抗体工作浓度为2 5 m L 时为最优组合，在该工作浓度下，显色反应明显，阴性背景值低。对捕获抗体、抗原及检测抗体孵育条件进行优化，如图5、图6 所示，捕获抗体4 包被过夜、抗原2 0 孵育4 5m i n、检测抗体2 0 孵育3 0m i n 时，P N 值最大，说明在该工作条件下，建立的c P 4 一E P s P s 蛋白双抗夹心E L I s A 检测方法效果最佳。2 4 双抗夹心EL|S A 法的灵敏度以c P 4 一E P s P s 蛋白浓度为横坐标，o D 4 5 0 值为纵坐标，建立标准曲线，如图7 所示，c P 4 一E P s P s 蛋白浓度在7 5 1 2 5n g m L 与0 D。，。值呈线性关系，表明双抗夹心E L I s A 方法对c P 4 一E P s P s 蛋白有效检测范围为7 5 1 2 5n g m L，线性方程为y=3 8 6 5 5 x+0 1 3 7 6，R 2=0 9 9 9 2。对2 0 份阴性样品进行检测，其检测0 D。，。平均值(x)为0 0 8 5 3，标准差(s D)O 0 2 2 1，根据公式+3 S D，得出0 1 5 1 6，将其代入线性方程，得1 D 128 0 9 27 0 4 07 0 3 8图3抗c P 4 一E P s P s 抗体特异性w e s t e mb l o t 鉴定F i g 3I d e n t i f i c a t i o no fa n t i C P 4 一E P S P Sa n t i b o d ys p e c i f i cW e s t e r nb l o t注：M：M a r k e r；阴：为P A T 蛋白；阳：c P 4 一E P s P s 蛋白1 D 1 0、2 D 3、6 A 6、l o H 4、l D l 2：均为单抗；8 0 9 2、7 0 4 0、7 0 3 8：均为多抗。阢他 钙弭拍万方数据s d e 礼c e 帆a 吼c h o t o 黟F 0 0 ah a 珏s 的表1 捕获抗体的确定7 I 铀l e1D e t e m i n a t i o no fc 印t u r ea n t i b o d y生物三程注：P 值为阳性样品O D。，。值；N 值为阴性样品0 D。值。表2 抗体最佳工作浓度确定T a b l e2D e t e 瑚i n a t i o no fo p t i m u mw o r k i n gc o n c e n t m t i o no fa m i b o d y注：表2 实验数据代表P N 值。F i g 43 02 52 0圣1 5l O5O图4 多克隆抗体效价测定D e t e c t i o no ft h et i t e ro fP A b sa g a i n s tC P 4 一E P S P S3 7 口h3 7 桫。?摹藩?鬻纂4 必蕊 1U 1 IV图5 捕获抗体孵育时间对检测结果的影响F i g 5E f f e c to fc 印t u r ea n t i b o d yi n c u b a t i o nt i m eo nt h er e s u l t so fd e t e c t i o n出该检测方法的最低检测限为3 6n g m L。2 5 重复性实验结果如表3 所示，对8 份样品检测，板内变异系数为0 9 2 7 9 8，板问变异系数为2 0 9 7 3 9，均小于1 5，表明建立的双抗夹心E L I s A 方法的重复性效果良好。2 6 检测转C I)4e p s p s 基因抗除草剂大豆本研究对转C p 4e p s p s 基因大豆材料的不同组织部位进行定量检测，表4 数据显示，c P 4 一E P s P s 蛋白在叶片中表达量最高，含量最高的为z L 一1 大豆，7 2 面砸丽2 01 61 284O图6F 噜6r 7 P 4、lI】。一抗原孵育+检测抗体孵育3 04 56 07 5时间(m i n)抗原和检测抗体孵育时间对检测结果的影响E f k c to fa n t i g e ni n c u b a t i o nt i m ea n dd e t e c t i o na n t i b o d yi n c u b a t i o nt i m eo nt e s tr e s u l t s寮oo24681 01 2c P 4 一E P s P s 蛋白(“m L)图7 双抗夹心E L I S A 标准曲线F i g 7T h es t a n d a r dc u n r eo fd o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c hE L I S A注：a：E L I s A 标准曲线；b：检测线。平均达到3 0 6 1 1 8 3 9 7 6 斗g g，蛋白在同一大豆植株的茎、种子、根中表达量依次降低，且显著低于叶片表达量。不同大豆在同一组织部位蛋白表达量也存在差异，例如，蛋白在茎中表达量最高的是z L 一1 0大豆，平均达到2 3 0 2 5 2 4 0 8 1 斗g g，表达量最低的是z L 一7 大豆，平均达到1 0 1 3 2 8 1 5 3 4 4 斗g g，表达量相差1 2 9 斗g g。综上所述，C P 4 一E P s P s 蛋白在大豆植株内各部位均有表达，且表达量差异显著。万方数据生物三程1 4 1，N o 1 4，2 0 2 0表3 重复性试验结果T a b l e3R e s u l t so fr e p e t i t i v ee x p e r i m e n tZ L 一1Z L 一2Z L 一3Z L 一4Z L 一5Z L 一6Z L 一7Z L 一8Z L 一9Z L 一1 08 7 1 4 6 3 3 0 9。6 5 6 2 5 1 7 4 5。9 0 0 1 6 2 0 0 1。8 7 7 2 1 3 7 5 2。8 1 9 8 1 2 9 9 5。7 6 8 1 6 3 3 0 9。7 8 8 2 5 2 9 9 5。8 3 1 2 9 3 7 3 0。6 8 2 0 8 0 5 7 3 D6 1 3 2 1 2 4 5 1 D11 7 8 5 6 5 5 8 4 61 6 3 3 0 9 2 2 8 0 4“1 4 9 0 7 6 1 3 8 9 5 61 2 8 8 7 5 1 1 4 2 2“1 1 2 8 0 6 士3 4 6 6 61 1 0 0 5 1 5 5 6 6 61 0 1 3 2 8 1 5 3 4 4“1 2 4 2 8 4 3 2 1 1 61 3 3 4 6 6 3 1 8 1 62 3 0 2 5 2 4 0 8 163 0 6 1 1 8 3 9 7 6“2 7 0 5 3 7 1 2 7 8 182 4 4 1 3 7 1 3 9 1 6 81 8 7 8 9 5 4 1 3 8“2 8 4 3 1 1 6 9 8 1“2 4 1 8 4 2 1 1 6 4 8 82 0 3 9 6 4 6 9 8 182 3 1 5 1 1 6 0 7 3“2 5 7 9 l1 2 0 6 6 82 6 4 7 9 8 8 6 6 5 81 0 1 5 3 1 0 4 9 5 8 61 0 5 4 4 6 0 3 2 1B 61 0 5 6 2 4 O 3 0 8 8 61 0 7 7 6 1 1 0 7 9 8 69 7 6 1 8 0 8 1 5 8 c1 0 2 5 9 8 1 3 2 9 8 68 4 8 8 7 0 8 9 18 c8 9 0 7 l 0 4 0 7 61 0 4 9 1 2 1 1 6 7 69 3 9 6 5】2 8 3 6注：表达量以鲜质量计算；同行上角标不同大写字母不同表示差异极显著(P 0 0 1)。3 结论与讨论本研究成功建立了c P 4 一E P s P s 蛋白双抗夹心E u s A 定量检测方法，该方法最低检测限为3 6n 昏r I l L，检测范围为7 5 1 2 5n g m L；重复性变异系数小于1 5。利用该方法定量检测转C p 4e p s p s 基因大豆的根、茎、叶和种子，发现C P 4 一E P S P S 蛋白在根、茎、叶、种子中均有表达，且表达量存在差异。本研究建立的检测方法中待测抗原及检测抗体的孵育温度均为2 0，在实际运用中，与同种类型的试剂盒相比，降低了对检测环境及设备的要求，同时，该检测方法中的检测抗体经H R P 标记，简化了操作步骤，缩短了检测时间旧“。目前，部分学者用2 株单抗建立双抗夹心E s A。2“，本研究中用单抗和多抗建立双抗夹心E u s A，是因为c P 4 一E P s P s 蛋白有多个抗原表位，单抗可以特异性识别并结合c P 4 一E P s P s 蛋白上的一个抗原表位，有利于捕获抗原，而多抗可以识别并结合c P 4 一E P s P s 蛋白上多个抗原表位，有助于放大检测信号；如选择单抗作为检测抗体，单抗识别的抗原表位可能被多抗占据，导致检测信号降低旧。目前，科研、海关、食品监督等部门对转基因生物的检测需求日益增多。所以建立一套转基因作物检测体系十分重要，本研究建立的c P 4 一E P s P s 蛋白双抗夹心E L I S A 检测方法能够快速准确地定量检测转C p 4e p s p s 基因抗除草剂大豆，为开发C P 4 一E P S P S蛋白检测试剂盒和试纸条提供基础，同时为我国转基因检测的发展和我国转基因作物的推广研究提供技术支持。参考文献 1 王南，李海燕转基因大豆概况及其安全性 J 吉林农业，2 0 1 6(1 9)：1 1 8 2 杜建中，郝曜山，王亦学，等我国转基因主粮作物产业化进展、存在问题及对策 J 生物技术进展，2 0 1 6，6(3)：1 5 9 1 6 8 3 侯红彩浅谈农业发展中除草剂的危害 J 现代农村科技2 0 1 9(3)：2 3 4 B e n b r o o k，c h a r l e sM T r e n d si n9 1 y p h o s a t eh e r b i c i d eu s ei nt l l eu n i t e ds t a t e sa n d 甜o b a l l y J E n v i m n m e n t a ls c i e n c e sE u m p e，2 0 1 6，2 8(1)：1 1 5 5 曹高赕，陈荣荣，杜锦5 一烯醇式丙酮酰一莽草酸一3 一磷酸合成酶(E P s P s)基因A M 7 9a m A 的活性位点分析 J 农业生物技术学报，2 0 1 5，2 3(5)：6 0 6 6 1 6 6 孙如建，孙宾成，张琪，等转C P 4 一E P 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s g e n i cP l a n t s H u m a n aP r e s s，N e wY o r k，N Y，2 0 1 9：4 11 4 1 7 1 6 D e m e k eT，D o