IL-6-ELISA-试剂盒操作说明(R&D).doc

IL-6 ELISA 试剂盒操作说明（R&D）注意：1. Calibrator Diluent RD6F 包含叠氮化钠（可能与铅和铜的管道）形成爆炸的金属叠氮化合物。处理期间用大量的水冲洗。2. 该盒的终止液为酸溶液。使用时戴眼睛、手、脸和衣服的防护。试剂准备：1. 使用前将所有试剂平衡至室温。2. 洗液（Wash Buffer）：如果浓缩液中已经形成结晶，平衡至室温，并轻轻地摇晃直到结晶完全溶解。加入去离子水或蒸馏水稀释20ml浓缩洗涤液至500ml。3. 底物溶液（Substrate Solution）：显色试剂A和B应该在使用前15min以等体积混合。避光保存。每孔需要200ul生成的混合物。4. IL-6标准品（IL-6 Standard）：使用5ml标准稀释液RD5T（Calibrator Diluent RD5T）（适用于细胞培养上清液样本）或标准稀释液RD6F（Calibrator Diluent RD6F）（适用于血清/血浆样本）重新配制IL-6标准品。重新配制的产品为300pg/ml贮存液。稀释前允许将标准品至少轻轻搅拌15min。5. 吸取适当的标准稀释液667ul到100pg/ml EP管，500ul稀释液到其它 EP管中。适用贮存液配制一系列的稀释液（如下）。进行下一次转移前充分地混匀各个EP管。没有稀释的标准品作为高标准。适当的标准稀释液作为0标准（0pg/ml）。测定步骤：使用前将所有试剂和样本平衡至室温。推荐所有的样本、标准和对照测定双份。1. 如前所示，准备所有的试剂和工作标准品。2. 取下多余的微量培养板条，放回装有干燥剂的锡箔袋中，重新密封。3. 每孔加入100ul Assay Diluent RD1W。4. 每孔依次加入100ul 标准品、样本和对照。用橡皮条密封。室温孵化2小时。记录测定标准和样本的分布。5. 吸弃孔内液体，每孔400ul洗涤液，充分洗涤后完全去除液体。在干净的纸上拍干。反复洗涤4次。6. 每孔加入200ul IL-6 Conjugate。用新的橡皮膏条密封。室温温浴2小时。7. 重复步骤5。8. 每孔加入200ul Substrate Solution。室温避光孵育20分钟。9. 每孔加入50ul Stop Solution。孔内颜色应该由蓝变黄。如果孔内颜色是绿色，或者颜色变化不均匀，轻轻拍打板子以确保充分混匀。10. 30分钟内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度，如果波长校正是有效的，设为540nm或570nm。如果波长校正不可用，从450nm波长读数减去540nm或570nm波长读数。这种方法可以校正板的光学缺陷。直接在450nm而无校正读数可能会偏高或偏低。测定步骤概要1. 按指示准备所有的反应物和标准。2. 每孔加入100ul Assay Diluent RD1W to each well。3. 每孔加入100ul 标准品、样品、或对照。室温温育2小时。4. 抽吸，洗涤4次。5. 每孔加入200ul Conjugate ，室温温育2小时。6. 抽吸，洗涤4次。7. 每孔加入200ul Substrate Solution。避光，室温温育20分钟。8. 每孔加入50ul Stop Solution。30分钟内在450nm读数，校正波长540nm或570nm。计算结果1.标准、对照、样本的OD值减去零标准的OD值，取两个复孔的均值。2.用4参数曲线，使用电脑软件建立标准曲线。3.如果样本已经被稀释了，由标准曲线得到的浓度必须乘以稀释倍数。技术提示1. 1.混合重新配制蛋白溶液时，避免起泡沫。2. 在标准品、样品的添加时，更换吸头，避免交叉污染。每个反应物也要使用分离的容器。3. 使用全自动洗板时，在添加洗液后加入一个30秒浸泡的程序，或者在洗板步骤之间将板旋转180°，可以提高测定的精确度。4. 为了保证正确的结果，孵育过程中板必须完全封闭。5. 底物溶液加到板中之前应该仍然是无色的。底物溶液避光保存。底物溶液应该由无色变为淡蓝色。6. 终止液和底物溶液应该以相同的顺序加到板中。加入终止液后空中的颜色将会由蓝变成黄色。孔中颜色为绿色表明终止液与底物溶液没有充分的混匀。灵敏度IL-6可以测到的最小剂量不低于0.70pg/ml。