实验一、蛋白质的两性电离及等电点测定.ppt

实实验验一一蛋蛋白白质质两两性性电电离离与与等等电电点点【教学目标教学目标】1 1、独立操作，一丝不苟地作实验。、独立操作，一丝不苟地作实验。2 2、仔细观察不同阶段试剂颜色变化及沉淀的出现、仔细观察不同阶段试剂颜色变化及沉淀的出现和消失，通过现象观察能分析蛋白质两性电离的和消失，通过现象观察能分析蛋白质两性电离的性质，正确填写实验报告。性质，正确填写实验报告。3 3、通过往五支不同、通过往五支不同pHpH值溶液的试管内加入酪蛋白，值溶液的试管内加入酪蛋白，观察沉淀出现的情况，确定其等电点。观察沉淀出现的情况，确定其等电点。4 4、共同讨论测定等电点的原理。、共同讨论测定等电点的原理。一、蛋白质的两性电离一、蛋白质的两性电离 多多肽肽链链中中氨氨基基酸酸残残基基中中有有可可解解离离基基团团，如如：末末端端-COO-COO-、-NH-NH3 3+，酸酸性性氨氨基基酸酸侧侧链链-COOCOO-，LysLys的的-NH-NH3 3+，ArgArg的的胍胍基基，HisHis的的咪唑基。咪唑基。*蛋白质的等电点蛋白质的等电点(pI)(pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于兼兼性性离离子子，净净电电荷荷为为零零，此时溶液的，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。NH3+NH3+NH2P P P COOH COO-COO-正离子 兼性离子 负离子 pHpI pH=pI pHpI+OH-+OH-+H+H+n各种蛋白质的氨基酸组成不同，解离情况不同，各种蛋白质的氨基酸组成不同，解离情况不同，等电点不同。多数接近等电点不同。多数接近5.05.0。蛋白质的性质之一：两性电离与等电点蛋白质的性质之一：两性电离与等电点【实验原理实验原理】蛋白质分子是两性电解质。蛋白质在溶液蛋白质分子是两性电解质。蛋白质在溶液的的pHpH值为等电点时游离为两性离子，溶解值为等电点时游离为两性离子，溶解度最低，容易沉淀析出。若在大于或小于度最低，容易沉淀析出。若在大于或小于等电点的溶液中，因蛋白质分子带有同种等电点的溶液中，因蛋白质分子带有同种电荷而相互排斥，不易产生沉淀。电荷而相互排斥，不易产生沉淀。【试剂试剂】1 1、0.50.5酪蛋白醋酸钠酪蛋白醋酸钠2 2、0.010.01溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂 变色范围是变色范围是pH3.8pH3.85.45.4。指示剂的酸色型为黄色，碱色型为蓝色。指示剂的酸色型为黄色，碱色型为蓝色。3 3、0.02mol0.02molL L盐酸溶液盐酸溶液 4 4、0.02mol0.02molL L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液5 5、1.00mol1.00molL L乙酸溶液乙酸溶液 6 6、0.10mol0.10molL L乙酸溶液乙酸溶液7 7、0.01mol0.01molL L乙酸溶液乙酸溶液【操作操作】1 1、蛋白质的两性电离、蛋白质的两性电离 （1 1）取一支试管，加入）取一支试管，加入0.50.5酪蛋白醋酸钠溶液酪蛋白醋酸钠溶液2020滴和滴和0.010.01溴甲酚绿指示剂溴甲酚绿指示剂2 2滴，摇匀。观察溶液颜色，记录，并滴，摇匀。观察溶液颜色，记录，并分析原因。分析原因。（2 2）用细滴管缓慢加入）用细滴管缓慢加入0.02mol/L0.02mol/L盐酸溶液，、边滴边摇，盐酸溶液，、边滴边摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pHpH值接近酪蛋白值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化，记录，分析原因。的等电点。观察溶液颜色的变化，记录，分析原因。（3 3）继续滴入）继续滴入0.02mol0.02molL L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，记录，分析原因。的变化，记录，分析原因。（4 4）再滴入）再滴入0.02mol0.02molL L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，记录，解释原因。当继续滴入出现沉淀，记录，解释原因。当继续滴入0.02mol0.02molL L氢氧氢氧化钠溶液时，观察沉淀和溶液颜色的变化。解释其原因。化钠溶液时，观察沉淀和溶液颜色的变化。解释其原因。作好记录。作好记录。结果及分析结果及分析 操作操作 实验结果实验结果 简要分析简要分析在酪蛋白溶液中加入在酪蛋白溶液中加入指示剂指示剂滴入滴入HCL至出现大量至出现大量 沉淀沉淀继续滴入继续滴入HCL滴入滴入NaOH溶液溶液继续滴入继续滴入NaOH溶液溶液至沉淀溶解至沉淀溶解2 2、酪蛋白等电点的测定、酪蛋白等电点的测定（1 1）取）取5 5支试管，编号后按下表的顺序准确地加入支试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂，然后混合均匀各种试剂，然后混合均匀(每管加入酪蛋白醋酸每管加入酪蛋白醋酸钠溶液后，须立即摇匀该管钠溶液后，须立即摇匀该管)。试剂试剂(ml)及管号及管号12345蒸蒸馏馏水（水（ml)1.6_3.01.53.40.01mol/L醋酸溶液醋酸溶液_2.50.60.10mol/L醋酸溶液醋酸溶液_4.01.0_1.0mol/L醋酸溶液醋酸溶液2.4_酪蛋白醋酸酪蛋白醋酸钠钠溶液溶液1.01.01.01.01.0溶液的最溶液的最终终pH3.24.14.75.35.9沉淀出沉淀出现现的多少的多少(2)(2)静置约静置约20 min20 min，观察每支试管中溶液的混浊度，以，观察每支试管中溶液的混浊度，以-，+，+，+，+符号表示沉淀的多少，将结果记录于上表符号表示沉淀的多少，将结果记录于上表中。中。（3 3）该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相）该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，实验中应当准确。除了需要精心配制试剂以外，实验中应严格按照定量分析的操作进行。严格按照定量分析的操作进行。思考题思考题根据实验观察结果，指出哪一支试管的根据实验观察结果，指出哪一支试管的pHpH是酪蛋是酪蛋白的等电点？在等电点时蛋白质的溶解度为什么白的等电点？在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。加以说明。