实验十三微生物生理生化.ppt

实实 验验 十三十三 微生物生理生化反应微生物生理生化反应IMViC试验试验 微生物生理生化反应微生物生理生化反应（IMViC）目的要求目的要求基本原理基本原理实验材料实验材料实验步骤实验步骤实验报告实验报告目的要求目的要求了解微生物生理生化反应的类型及意义；了解微生物生理生化反应的类型及意义；掌握掌握IMViC反应的原理及其在肠道菌鉴反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。定中的意义和方法。基本原理 微生物体内各种酶系统控制的复杂多样的生化反应完微生物体内各种酶系统控制的复杂多样的生化反应完成成；测定微生物某些酶类的有无、对底物作用与否、；测定微生物某些酶类的有无、对底物作用与否、反应的条件、反应的产物及代谢方式都属于生理生化反应的条件、反应的产物及代谢方式都属于生理生化实验内容。实验内容。在培养基内或在培养完成之后加入特定的指示剂就可在培养基内或在培养完成之后加入特定的指示剂就可确定所发生的生理生化反应类型。确定所发生的生理生化反应类型。常用的试验：糖代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、常用的试验：糖代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、氮源和碳源的利用试验及酶的试验等。氮源和碳源的利用试验及酶的试验等。基本原理基本原理IMViC是吲哚吲哚(indoltest)、甲基红甲基红(methy1redtest)、伏一普伏一普(Voges-Prokauertest)和柠檬酸盐柠檬酸盐(citratetest)四个试验的缩写，I是在英文中为了发音方便而加上的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，多用于水的细菌学检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。基本原理基本原理吲哚试验吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。色氨酸水解反应：吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。基本原理基本原理甲基红试验甲基红试验。某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中的糖先分解为丙酮酸，丙酮酸再分解为甲酸、乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂pH42（红色）-63（黄色），可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。基本原理基本原理伏伏-普试验普试验。某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，。某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏成红色化合物，即伏-普反应阳性，没有红色化普反应阳性，没有红色化合物产生则为阴性。其反应过程如下：合物产生则为阴性。其反应过程如下：产气肠杆菌伏产气肠杆菌伏-普反应阳性，大肠杆菌伏普反应阳性，大肠杆菌伏-普反应阴性。普反应阴性。基本原理基本原理柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验。有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，例如大肠杆菌；而另一些细菌不能利用柠檬酸钠，例如产气肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，在有1%溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于60时呈黄色，pH在60-76时为绿色，pH大于76时呈蓝色。实验材料实验材料菌种菌种：大肠杆菌，产气肠杆菌；：大肠杆菌，产气肠杆菌；培养基：培养基：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基水培养基，柠檬酸盐斜面培养基。试剂：试剂：甲基红试剂，甲基红试剂，40KOH，5-萘酚，萘酚，乙醚，吲哚试剂等乙醚，吲哚试剂等。实验步骤实验步骤1.接种与培养接种与培养将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基中（做吲哚试验吲哚试验），4支葡萄糖蛋白胨水培养基中（做甲基红试验与伏甲基红试验与伏-普普试验试验），2支柠檬酸盐斜面培养基中。置37温室培养48h以上。实验步骤实验步骤2.结果观察结果观察(1)吲哚试验：培养后取出，先加入乙醚约1ml（使呈现明显的乙醚层），充分震荡后，沿试管壁缓缓滴加吲哚试剂5-10滴，观察有无红色环出现。注意：加入吲哚试剂后不可再动摇不可再动摇!有红色环出现者为阳性，反之为阴性。(2)甲基红试验：将葡萄糖蛋白胨水培养物加甲基红试剂2滴，培养基变红色者为阳性，变黄色者为阴性。(3)伏-普试验：培养物中加入等量的VP试剂，用力振荡，再放入37温箱中保温15-30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色者为伏-普反应阳性。(4)柠檬酸盐试验：观察柠檬酸盐培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。实验报告实验报告1.结果结果将实验结果填入下表。将实验结果填入下表。“+”表示阳性反应；表示阳性反应；“-”表示阴性反应。表示阴性反应。菌名IMViC试验吲哚试验甲基红试验伏-普试验柠檬酸试验大肠杆菌产气肠杆菌实验报告实验报告2.思考题思考题（1）为什么说进行生理生化试验必须是纯培为什么说进行生理生化试验必须是纯培养？养？（2）培养物中的吲哚是怎样产生的？又是通培养物中的吲哚是怎样产生的？又是通过什么方法来测定的？过什么方法来测定的？