实验四酶联免疫吸附试验ELISA.ppt
实验四实验四 阻断酶联免疫吸附试验阻断酶联免疫吸附试验（阻断（阻断ELISA)ELISA)免疫标记技术免疫标记技术1.1.定义：定义：2.2.将抗原将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用抗体反应与标记技术相结合，用放放射性同位素、酶或荧光素射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.2.分类：分类：放射免疫测定法：放射免疫测定法：131131I I，3232P P免疫荧光技术：免疫荧光技术：FITCFITC，PEPE免疫酶测定法：免疫酶测定法：HRPHRP，APAP免疫酶测定法免疫酶测定法(E Enzyme nzyme I ImmunommunoA Assay,EIA)ssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)(HRP)(HRP)，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶(AP)(AP)(AP)(AP)特点：特点：特点：特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pgpgpgpg水平微量检测水平微量检测水平微量检测水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类：分类：分类：分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。组织中或细胞表面的抗原。组织中或细胞表面的抗原。组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E Enzyme-nzyme-L Linked inked I ImmunommunoS Sorbent orbent A Assay,ELISA)ssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。中未知抗体或抗原的方法。1.1.定义定义2.2.原理原理（1 1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。与酶连接。（2 2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3.3.常用常用种类种类直接法（直接法（直接法（直接法（direct ELISAdirect ELISA）：）：）：）：将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体检测抗体检测抗体间接法（间接法（间接法（间接法（Indirect ELISAIndirect ELISA）：）：）：）：将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗检测检测液相中未知抗体液相中未知抗体双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（双抗体夹心法（Sandwich ELISA)Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的检测液相中的可溶性抗原可溶性抗原竞争法（竞争法（竞争法（竞争法（Competitive ELISA)Competitive ELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性检测液相中的可溶性抗原或抗体抗原或抗体阻断法（阻断法（阻断法（阻断法（Block ELISA)Block ELISA)：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体检测液相中的可溶性检测液相中的可溶性抗体抗体（1 1 1 1）直接法测定抗原直接法测定抗原直接法测定抗原直接法测定抗原A.A.A.A.将抗原吸附在载体表面；将抗原吸附在载体表面；将抗原吸附在载体表面；将抗原吸附在载体表面；B.B.B.B.加酶标抗体，形成抗原加酶标抗体，形成抗原加酶标抗体，形成抗原加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；抗体复合物；抗体复合物；抗体复合物；C.C.C.C.加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。（2 2 2 2）间接法测定）间接法测定）间接法测定）间接法测定抗体抗体抗体抗体A.A.A.A.将将将将抗原抗原抗原抗原吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；B.B.B.B.加抗体加抗体加抗体加抗体,形成抗原形成抗原形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.加酶标抗体；加酶标抗体；加酶标抗体；加酶标抗体；D.D.D.D.加底物。测定底物的降解量抗体量。加底物。测定底物的降解量抗体量。加底物。测定底物的降解量抗体量。加底物。测定底物的降解量抗体量。（3 3 3 3）双抗体双抗体双抗体双抗体夹心法测定夹心法测定夹心法测定夹心法测定抗原抗原抗原抗原A.A.A.A.将将将将抗体抗体抗体抗体吸附于固相表面吸附于固相表面吸附于固相表面吸附于固相表面;B.B.B.B.加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.加酶标抗体加酶标抗体加酶标抗体加酶标抗体;E.E.E.E.加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。（4 4 4 4）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原A.A.A.A.将抗体吸附在固相载体表面将抗体吸附在固相载体表面将抗体吸附在固相载体表面将抗体吸附在固相载体表面;B.B.B.B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原；C.C.C.C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。（5 5 5 5）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体本本本本法法法法主主主主要要要要用用用用于于于于检检检检测测测测型型型型特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体体体体。该该该该方方方方法法法法现现现现已已已已成成成成为为为为猪猪猪猪传传传传染染染染性性性性胃胃胃胃肠肠肠肠炎炎炎炎（TGETGE）、猪猪猪猪伪伪伪伪狂狂狂狂犬犬犬犬病病病病（PRPR）及及及及猪猪猪猪胸膜肺炎（胸膜肺炎（胸膜肺炎（胸膜肺炎（APAP）的主要检测方法。）的主要检测方法。）的主要检测方法。）的主要检测方法。A.A.A.A.将抗原吸附在固相载体表面将抗原吸附在固相载体表面将抗原吸附在固相载体表面将抗原吸附在固相载体表面;B.B.B.B.先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体）,形成抗原形成抗原形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物抗体复合物抗体复合物;C.C.C.C.再加酶标单抗；再加酶标单抗；再加酶标单抗；再加酶标单抗；D.D.D.D.加底物。加底物。加底物。加底物。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(E E E Enzyme-nzyme-nzyme-nzyme-L L L Linked inked inked inked I I I ImmunommunommunommunoS S S Sorbent orbent orbent orbent A A A Assay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)ssay,ELISA)4.4.原理原理（以（以ELISA为例）为例）：显色显色显色显色酶标单抗酶标单抗酶标单抗酶标单抗实验材料实验材料猪伪狂犬病毒（猪伪狂犬病毒（PRVPRV）抗原抗原阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照样品样品 待测猪血清待测猪血清HRPHRP标记猪标记猪PRVPRV单抗单抗 酶标单抗酶标单抗包被缓冲液：包被缓冲液：0.025M pH9.60.025M pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液洗涤液：含洗涤液：含0.05%0.05%TweenTween 20 20的的0.01M pH7.4 PBS0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液：底物缓冲液：pH5.0pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：底物溶液：TMBTMB（四甲基联苯胺）（四甲基联苯胺），底物缓冲液，底物缓冲液，30%H30%H2 2O O2 2，新鲜配制新鲜配制酶标板，酶标仪酶标板，酶标仪阻断法测定猪伪狂犬病病毒阻断法测定猪伪狂犬病病毒ELISAELISA抗体抗体 定性检测定性检测实验方法实验方法1.1.抗原的处理：抗原的处理：2.2.包被抗原：包被抗原：取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入取酶标板，加入100L/100L/100L/100L/孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液4444，湿盒内，湿盒内，湿盒内，湿盒内，18h18h18h18h取出包被好抗原的酶标板（取出包被好抗原的酶标板（4 4孔孔/组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次3.3.加待测血清加待测血清标记各孔，加入相应液体标记各孔，加入相应液体100L/100L/孔孔1234阴阴性性空空白白阳阳性性待待测测4.4.加单抗：加单抗：3737，湿盒内，湿盒内，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次各孔加入酶标单抗各孔加入酶标单抗100L/100L/孔孔3737，湿盒内，湿盒内，30min30min5.5.显色：显色：甩干孔内液体甩干孔内液体以洗涤液（以洗涤液（200L/200L/孔）洗涤孔）洗涤3 3次，次，3min/3min/次次加入底物溶液加入底物溶液100L/100L/孔孔避光显色，避光显色，10min10min6.6.观察结果观察结果实验方法实验方法1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待）将待检血清检血清1 1稀释后加入板孔中，每孔加稀释后加入板孔中，每孔加100l。同样。同样1 1稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，孔，每孔每孔100l。另设一空白对照孔，空白对照孔加。另设一空白对照孔，空白对照孔加100l稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37温育温育30分钟。分钟。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。次。3、每孔加酶标单抗、每孔加酶标单抗100l，置，置37温育温育30分钟。分钟。4、洗板：洗涤、洗板：洗涤3次（方法同步骤次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。）。切记每次在干吸水纸上拍干。5、显色与终止：每孔先加底物、显色与终止：每孔先加底物A液、再液、再B液各液各1滴滴(50l)，混匀。室温（，混匀。室温（18-25）避光显色）避光显色10分钟后。分钟后。6、终止：每孔加终止液、终止：每孔加终止液1滴滴(50l)（0.25%氢氟酸），终止反应。氢氟酸），终止反应。7、10分钟内测定结果。采用波长分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定的酶标仪测定OD值。检测样本的值。检测样本的OD值值0.35为阳性为阳性8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均值与阳性对照孔平均OD630值之差值之差0.40.4。S=样品孔样品孔OD630值，值，N=阴性对照孔阴性对照孔OD630值值如果如果S/N比值比值0.60.6，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阳性。抗体阳性。如果如果S/N比值比值0.70.7但但 0.6 0.6，样品重测。，样品重测。如果如果S/N比值比值 0.7 0.7，样品判定为，样品判定为PRVPRV抗体阴性抗体阴性具体操作步骤具体操作步骤预期结果预期结果阴性：显色为阴性：显色为蓝色蓝色阳性：无色阳性：无色1 2 3 4阳性阳性阳性阳性 阴性阴性阴性阴性常用酶及底物常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色棕黄色蓝色黄色注意事项注意事项1、ELISA实验前血清样品尽量做到实验前血清样品尽量做到37灭活灭活30分钟。分钟。2、在、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中的助溶剂吐温叠引起非特异性吸附。洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低非特具有降低非特异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。干。3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。分钟内完成。
