实验六血清ALT活性测定.ppt
实验六实验六 血清血清ALT活性测定活性测定一、何谓一、何谓ALT？谷丙转氨酶谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminaseglutamic pyruvic transaminase，GPTGPT）丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferasealanine aminotransferase，ALTALT）复习复习：n 反应式反应式大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。二、二、ALTALT催化的化学反应催化的化学反应:丙氨酸丙氨酸 +-酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸 +谷氨酸谷氨酸ALTALTALTALT三、三、ALT的分布的分布:主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等，血主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等，血清中的含量很低。清中的含量很低。病变时，细胞受损，血清病变时，细胞受损，血清ALTALT含量升高。含量升高。四、四、ALT测定的临床意义：测定的临床意义：作为（肝脏）疾病诊断和预后判断的指作为（肝脏）疾病诊断和预后判断的指标之一。标之一。五、测定血清五、测定血清ALT的方法：的方法：King法法（金氏法）（金氏法）（金氏法）（金氏法）Reitman法法（赖氏法）（赖氏法）（赖氏法）（赖氏法）Mohun法法（穆氏法）（穆氏法）（穆氏法）（穆氏法）1981年全国生化检验方法学讨论会确定年全国生化检验方法学讨论会确定用赖氏法（改良）作为临床首选，单位为：用赖氏法（改良）作为临床首选，单位为：卡门氏单位卡门氏单位。实验六实验六 血清血清ALT活性测定活性测定 -改良赖氏法改良赖氏法 一、实验性质：一、实验性质：分析性分析性二、目的及要求二、目的及要求 1、掌握、掌握ALT测定的原理及临床意义测定的原理及临床意义 2、熟习测定的操作方法。、熟习测定的操作方法。丙氨酸丙氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸+谷氨酸谷氨酸 ALTALTALTALT（血清血清）基质液基质液 在一定反在一定反应应条件下条件下(pH7.4，37),作用作用 30 min：三、原理三、原理：-酮戊二酸酮戊二酸丙酮酸丙酮酸 +2,4+2,4 二硝基苯肼二硝基苯肼-酮戊二酸酮戊二酸-2,4-2,4二硝基苯腙二硝基苯腙丙酮酸丙酮酸-2,4-2,4 二硝基苯腙二硝基苯腙 两者在两者在两者在两者在 碱性条件下碱性条件下碱性条件下碱性条件下 呈呈呈呈 红棕色红棕色红棕色红棕色 ，等摩尔浓度条件，等摩尔浓度条件，等摩尔浓度条件，等摩尔浓度条件下，丙酮酸下，丙酮酸下，丙酮酸下，丙酮酸 OD OD 值值值值 大大大大 a-a-酮戊二酸酮戊二酸酮戊二酸酮戊二酸 3 3倍。倍。倍。倍。四、试剂：四、试剂：省略省略省略省略 2 2 2 2、按下表操作：按下表操作：按下表操作：按下表操作：加入物加入物加入物加入物 （mlmlmlml）对照管对照管对照管对照管 (B)(B)(B)(B)测定管测定管测定管测定管 (U)(U)(U)(U)血清血清血清血清 0.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.1 基质缓冲液基质缓冲液基质缓冲液基质缓冲液 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，混匀，混匀，混匀，37373737水浴水浴水浴水浴30min30min30min30min（准确记时）（准确记时）（准确记时）（准确记时）2,42,42,42,4二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 基质缓冲液基质缓冲液基质缓冲液基质缓冲液 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，混匀，混匀，混匀，37373737水浴水浴水浴水浴20min20min20min20min；各管加入各管加入各管加入各管加入0.4 M0.4 M0.4 M0.4 M NaOH NaOH NaOH NaOH 5.0 ml5.0 ml5.0 ml5.0 ml，室温放置，室温放置，室温放置，室温放置10 min10 min10 min10 min；在波长在波长在波长在波长505505505505 nmnmnmnm 处，以处，以处，以处，以蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水校正零点，读取各管吸光校正零点，读取各管吸光校正零点，读取各管吸光校正零点，读取各管吸光 度；根据度；根据度；根据度；根据 (A(AU U-A-AB B)标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。1 1、将、将、将、将 基质缓冲液基质缓冲液基质缓冲液基质缓冲液 和和和和 血清血清血清血清 在在在在 3737 水浴箱水浴箱水浴箱水浴箱 预温预温预温预温5min5min。五、操作步骤：五、操作步骤：3 3、标准曲线的绘制：、标准曲线的绘制：、标准曲线的绘制：、标准曲线的绘制：管号管号管号管号 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（mlmlmlml）0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 丙酮酸标准液（丙酮酸标准液（丙酮酸标准液（丙酮酸标准液（mlmlmlml）0.05 0.10 0.15 0.20 0.05 0.10 0.15 0.20 0.05 0.10 0.15 0.20 0.05 0.10 0.15 0.20 基质缓冲液（基质缓冲液（基质缓冲液（基质缓冲液（mlmlmlml）0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30相当于酶活性相当于酶活性相当于酶活性相当于酶活性 （卡门氏单位）（卡门氏单位）（卡门氏单位）（卡门氏单位）28 57 97 150 28 57 97 150 28 57 97 150 28 57 97 150各管加各管加各管加各管加 2,4-2,4-2,4-2,4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液0.5 ml0.5 ml0.5 ml0.5 ml，混匀，混匀，混匀，混匀，37373737水浴水浴水浴水浴 20min20min20min20min；各管加各管加各管加各管加 0.4 mol/L NaOH0.4 mol/L NaOH0.4 mol/L NaOH0.4 mol/L NaOH溶液溶液溶液溶液5.0 ml5.0 ml5.0 ml5.0 ml，混匀，室温放置，混匀，室温放置，混匀，室温放置，混匀，室温放置10min10min10min10min。波长波长波长波长505 nm505 nm505 nm505 nm处比色，以处比色，以处比色，以处比色，以蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水调零点，读取各管吸光度；调零点，读取各管吸光度；调零点，读取各管吸光度；调零点，读取各管吸光度；各管读数均减去各管读数均减去各管读数均减去各管读数均减去0 0 0 0号管号管号管号管吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性单位作图即成标准曲线。单位作图即成标准曲线。单位作图即成标准曲线。单位作图即成标准曲线。六、结果分析：六、结果分析：正常参考值：正常参考值：正常参考值：正常参考值：5 52525卡门氏单位卡门氏单位卡门氏单位卡门氏单位七、注意事项：七、注意事项：1一般血清标本内源性酮酸很少，血一般血清标本内源性酮酸很少，血清对照管吸光度读数接近清对照管吸光度读数接近试剂空白管试剂空白管(以以0.1ml蒸馏水或生理盐水代替血清，其它和对蒸馏水或生理盐水代替血清，其它和对照管同样操作照管同样操作)，所以大批标本测定时，一般，所以大批标本测定时，一般不需要每一标本都作血清对照管，以不需要每一标本都作血清对照管，以试剂空试剂空白管白管代替即可。但建议对超过正常的标本进代替即可。但建议对超过正常的标本进行复查，复查时每份标本应作对照管。行复查，复查时每份标本应作对照管。2严重脂血症或黄疸、溶血的血清可严重脂血症或黄疸、溶血的血清可能会引起测定管吸光度增加，因此检测此类能会引起测定管吸光度增加，因此检测此类标本时，应作血清对照管。标本时，应作血清对照管。3赖氏法原法标准曲线只到赖氏法原法标准曲线只到97卡门卡门氏单位，直线关系很好。超过此活力的标本氏单位，直线关系很好。超过此活力的标本应稀释后再测，临床上应用甚为不便，故卫应稀释后再测，临床上应用甚为不便，故卫生部临检中心推荐法建议标准曲线延长到生部临检中心推荐法建议标准曲线延长到150卡门氏单位，实际已不完全成直线了，卡门氏单位，实际已不完全成直线了，只能大致反应酶活性的大小、当血清标本酶只能大致反应酶活性的大小、当血清标本酶活性超过活性超过150卡门氏单位时，应将血清用生卡门氏单位时，应将血清用生理盐水或缓冲液稀释理盐水或缓冲液稀释5倍后再进倍后再进行测定。行测定。4加入加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分二硝基苯肼溶液后需充分振荡混匀，否则会影响重复性；振荡混匀，否则会影响重复性；加氢氧化加氢氧化钠溶液钠溶液方法要一致，不同方法也会导致吸方法要一致，不同方法也会导致吸光度读数的差异。光度读数的差异。5基质缓冲液和基质缓冲液和 2,4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液配制必须准确，每次测定时空白管吸光度配制必须准确，每次测定时空白管吸光度上下波动不应超过上下波动不应超过0.015，如超出此范围应，如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。检查试剂及仪器等方面的问题。八八、实验报告、实验报告：九、思考题：九、思考题：1、实验目的及要求：、实验目的及要求：2、实验原理：、实验原理：3、材料与方法：、材料与方法：只写自己所完成的操作只写自己所完成的操作4、实验结果：、实验结果：原始结果、计算结果、标准曲线原始结果、计算结果、标准曲线5、体会：、体会：结合具体情况结合具体情况
