GB∕T 40194-2021 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准GB/T 40194-2021 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Brle y stri pe moslC Vlrus 2021-05-21发布国家市场监督管理总局Lg.-/;-国家标准化管理委员会以叩2021-12-01实施G/T 40194-2021 目。吕本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:张永江、沈建国、辛言言。I 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了大麦条纹花叶病毒的血清学和分子生物学检疫鉴定方法。本文件适用于可能带有大麦条纹花叶病毒的植物及其产品的检疫鉴定。2 规范性引用文件G/T 40194-2021 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 大麦条纹花叶病毒基本信息学名:Barleyst门户emosalC Vlrus 缩写:BSMV异名:Brleyfilse sti户eVIus、Bleymild stri户emosIC Vlrus、Brleymild st门户eVlrus、Barley mosaic vius、B-leyst门户emosaic hodeivius、Barleyvery mild st门户emosalC Vlrus、Oatstn户emosIC Vlrus、SetriemosalC VIus 分类地位:马泰利病毒目CMtellivirales)植物杆状病毒科CVigiridae)大麦病毒属CHordei virus)成员。大麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录A。5 方法原理大麦条纹花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据BSMV与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定CDAS-ELISA);依据BSMV的基因组特征进行RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测;通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有BSMV。6 仪器用具与试剂6.1 仪器设备6.1.1 电子天平(感量0.001g)。6.1.2 高速冷冻离心机。G/T 40194-2021 6.1.3 微型瞬时离心机。6.1.4 普通冰箱。6.1.5 超低温冰箱(-80OC)。6.1.6 制冰机。6.1.7 涡旋振荡器。6.1.8 磁力搅拌器。6.1.9 高压灭菌锅。6.1.10 pH 计。6.1.11 超净工作台。6.1.12 实时荧光定量PCR仪。6.1.13 PCR 义。6.1.14 微波炉。6.1.15 电泳仪。6.1.16 电泳槽。6.1.17 凝胶成像分析仪。6.1.18 洗板机。6.1.19 酶标仪。6.1.20 酶联板。6.1.21 可调移液器(2.5L、10L、20L、100L、200L、1000L)。6.1.22 可调移液器头。6.1.23 Eppendorf管。6.1.24 研钵。6.1.25 微型磨样。6.2 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682中相关规定。6.2.1 DAS-ELISA检测试剂，制备按附录B中B.1执行。6.2.2 RT-PCR检测试剂，制备按附录C中C.1执行。6.2.3 实时荧光RT-PCR检测试剂，制备按附录D中D.1执行。7 检测样晶的制备7.1 种子挑取畸形、不成熟种子播于灭菌士中，待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号;未表现症状的植株分组00株为1组)并编号，采集的未表现症状的叶片分成2份;用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。7.2 植株对于有症状(如叶片条纹、花叶、褐色细小斑点等)的植株，每个植株编号并进行单株检测。没有症状的分组并编号后按组进行检测，分组方法和检测方法同7.1。7.3 植物产品植物产品有症状的部分(如条纹、花叶等)单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，分2 G/T 40194-2021 组编号，分组方法和检测方法同7.1。8 检测鉴定8.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定包被抗体后，再把制备的样品上清液加入已包被BSMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染BSMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作按B.2的规定执行。8.2 RT-PCR中金泪RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作按C.2的规定执行。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。8.3 实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作按D.2和D.3的规定执行。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。9 结果判定DAS-ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR检测方法按照B.3、C.3、D.4的判定方法进行判定，其中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带BSMV。10 样品保存与结果记录10.1 样晶保存经检测确定携带BSMV的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥室温环境中;种苗、叶片等样品保存在超低温冰箱(-80OC)中;做好登记和标记工作，保存期限至少1年。10.2 结果记录记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图。3 G/T 40194-2021 A.1 寄主范围附录A(资料性)大麦条纹花叶病毒相关资料寄主范围有限，自然寄主主要为大麦CHordmvulgare)、栽培二棱大麦CH.distichon)、小麦C Triticum aestivum)和野燕麦CAvenafatu)。A.2 危害症状受侵染的大麦在兰叶期时即出现褐色分散的细小斑点，后逐渐增多引起叶片枯死。有的品种沿叶片中脉出现褐色条斑，在上部叶片出现黄绿相间的花叶和斑驳。轻病株能抽穗，但千粒重明显降低。小麦感染大麦条纹花叶病毒，发病轻的，叶片上只有褪绿小斑驳;发病中等的，在叶片上出现较大的褪绿斑驳;发病中等偏重的，则出现黄色花叶或坏死斑块;发病严重的则使整张叶片变成黄白色。病株所结种子不饱满，千粒重不同程度地降低。A.3 分布地区中国、以色列、日本、韩国、黎巴嫩、巴基斯坦、叙利亚、突尼斯、土耳其、埃及、澳大利亚、新西兰、丹麦、匈牙利、罗马尼亚、德国、墨西哥、美国、阿根廷、巴西、秘鲁、加拿大、南非、俄罗斯、智利、波兰、保加利亚、芬兰、捷克、葡萄牙、摩尔多瓦、瑞士、塞尔维亚、黑山、斯洛伐克、斯洛文尼亚、乌克兰、希腊、意大利、英国、朝鲜。A.4 传播方式该病毒主要通过种子传播，也可通过花粉传播。种传率分别为大麦90%100%，小麦7%81%，野燕麦22%，燕麦010%，长穗燕麦草22%，无芒燕麦8%，鸭町草8%，玉米90%100%，黑麦草属3%8%。A.5 粒体形态病毒粒体为棒状，长度在50nm150 nm，大多数为110nm;直径约为20nm。A.6 基因组基因组为正单链RNA，由三个组分组成，其中组分RNA的长度约3.7kb，组分RNA卢的长度约3.2 kb，组分RNAy的长度在不同株系问差别较大，约2.7 kb3.1 kb。4 B.1 试剂B.1.1 包被抗体附录B(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定CDAS-ELISA)G/T 40194-2021 特异性大麦条纹花叶病毒抗体。建议使用商品化试剂盒抗体;4oc保存不超过1年;抗体使用时的稀释比例按说明书要求稀释。B.1.2 酶标抗体碱性磷酸醋酶标记的大麦条纹花叶病毒抗体。B.1.3 底物对硝基苯磷酸二铀CpNPP)。B.1.4 1 X PST缓冲液CpH7.4)氯化铀CNaCD磷酸二氢饵CKHzP04)磷酸氢二锅CNazHP04)氯化专甲CKCD8.0 g 0.2 g 1.15 g 0.2 g 吐温-20CTween-20)0.5 mL 加入900mL双蒸水并用磁力搅拌器搅拌，用pH计调节至7.4，并定容至1000 mL,4 oc储存。B.1.5 样品抽提缓冲液CpH7.4)亚硫酸纳CNaZS03)1.3g 聚乙烯基毗咯皖酣Cpvp，MW24 000-40 000)20.0 g 溶于900mL的1XPBST中，并用1XPBST定容至1000 mL,4 oc储存。B.1.6 包被缓冲液CpH9.6)碳酸铀CNaZC03)1.59 g 碳酸氢铀CNaHC03)2.93 g 溶于900mL双蒸水中，并定容至1000 mL,4 oc储存。B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液CpH7.4)牛血清白蛋白CBSA)2.0 g 聚乙烯基口比咯皖国同Cpvp，MW24 000-40 000)20.0 g 溶于900mL 1 X PBST中，并用1XPBST定容至1000 mL,4 oc储存。B.1.8 底物缓冲液CpH9.8)二乙醇胶97 mL 5 G/T 40194-2021 氯化镇CMgClz)0.1 g 溶于800mL双蒸水中，用浓盐酸CHCl)调pH至9.8，定容至1000 mL,4 oc储存。B.2 试验步骤B.2.1 包被抗体按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100L。酶联板加盖或用保鲜膜包好，37oc孵育2h。清空孔中溶液，用1X PBST加满各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。B.2.2 样晶制备与加样待测样品、阴性对照及阳性对照按1:10CW/V)加入抽提缓冲液，在研钵中研磨;将样品研磨液倒入离心管中，5000 r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照也可以按试剂盒说明书进行处理。按100L/孔分别加入制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜膜包好，4oc孵育过夜。酶联板用自来水彻底冲洗，再用1XPBST洗涤3次，每次3min;或用洗板机自动清洗3次。B.2.3 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液，按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加入到酶联板中，100L/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37oc孵育4h。酶联板用自来水彻底冲洗，再用1XPBST洗涤3次，每次3min;或用洗板机自动清洗3次。B.2.4 加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mLC现配现用)，100L/孔加入到酶联板中，室温避光孵育。B.2.5 读数在不同的时间内如30min,60 min、90min、120min或更长时间，用酶标仪在405nm处读OD值。B.3 结果判定B.3.1 质量控制要求对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内，即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值0.15，当阴性对照孔的OD405值5;同一样品的重复性基本一致。B.3.2 结果判定在满足B.3.1的质量控制要求后，结果原则上可判断如下:样品OD405值/阴性对照OD405值2，判为阳性;样品OD405值/阴性对照OD405值为2时，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证;样品OD405值/阴性对照OD405值2，判为阴性。若不满足B.3.1的质量控制要求，则不能进行结果判断。6 C.1 试剂C.1.1 核酸提取试剂Trizol或合格的RNA提取试剂盒。C.1.2 电泳缓冲液TAEC50X)兰泾甲基氨基甲皖CTris)冰乙酸CC2H4 O2)乙二胶四乙酸二铀CNa2EDTA.2H20)附录C(规范性)RT-PCR检测双蒸水定容至1000 mL，用时稀释至1XTAE。C.2 检测步骤C.2.1 核酸提取242 g 57.1 mL 37.2 g G/T 40194-2021 用电子天平称取0.1g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5mL离心管(用高压灭菌锅高压灭菌)中，加人1mL的TrizoL试剂，用涡旋振荡器剧烈振荡3min;用高速冷冻离心机4oC 12 000 r/min离心10min;将上清液移入一新离心管中，加入0.5mL兰氯甲烧，猛烈振荡15s;4 oC 12 000 r/min离心15min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加入等体积异丙醇，混匀;室温静置10 min;4 oC 12 000 r/min离心10mi口，弃上清液;加人1mL 75%的冷乙醇洗涤沉淀;4 oC 10 000 r/min离心10min，弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于30LDEPC-H20中，微型瞬时离心机瞬离，置于普通冰箱-20oC保存备用。注:此处以0.1g样品为例进行核酸提取，实际检测时如样品量有变化，加入的试剂可按比例调整;或者按照商品化RNA提取试剂盒进行操作。C.2.2 号|物序列上游引物BSMVF:5-AGGATCAATGGGATACACAAGTT-3 下游引物BSMVR:5-TTCGAAAGTCTTCCTGGTATACAC-3 产物大小:503 bp。C.2.3 反转录反转录总体系为20Lo0.2 mL PCR管中加人总RNA1L，dNTPs(1 0 mmol/L)lL，DEPC处理水10L，BSMVRC20mol/L)2L，70oC保温5min;冰上(用制冰机制备碎冰)放置5min;再加入5 X buffer 4L，RNasinC40 U/L)1L，M-MLVC200 U/L)1L，420C保温1h，得到cDNA后用作PCR的模板。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。C.2.4 PCR扩增0.2 mL PCR管中加入10X PCR bufferC含Mg2十)2L，dNTPs(10 mmol/L)0.6L，BSMVF及BSMVRC均为20mol/L)各0.5L，2U/L Taq酶1L，cDNA模板2L和DEPC处理水13.4L。G/T 40194-2021 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。试剂全部加入后将PCR管放置到PCR仪中进行反应。反应程序:95 oC,8 m i n;95 oC,45 S;58 oC,45 S;72 oC,1 m i n;40个循环，72 oC,10m i n。注:如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒，可按照说明书进行操作，将步骤C.2.3和C.2.4合并进行。C.2.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳用微波炉将琼脂糖融化后制备1%的琼脂糖凝胶并放入电泳槽，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，用电泳仪进行电泳。电泳结束后在凝胶成像分析仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。C.3 结果判定阳性对照在503bp左右处有条带，阴性对照和空白对照无特异性条带，待测样品出现与阳性对照一致的条带，可判定为阳性。阳性对照在503bp左右处有条带，阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带，可判定结果为阴性。8 附录D(规范性)实时荧光RT-PCR检测D.1 试剂D.1.1 核酸提取试剂同C.1.1。D.1.2 TaqMan One-step RT-PCR Mixtureo D.1.3 引物探针:上游引物BSMVF:5-CGGAATCGGTGTCGTTGGA-3 下游引物BSMVR:5-CTCTTTGACCCGTCTCTGTAACTACC-3 G/T 40194-2021 探针BSMVP:5-FAM-AAATCAAAAACATTCTACGGAATCCGG-TAMRA-3。D.2 核酸提取方法同C.2.LD.3 实时荧光RT-PCR反应反应体系:0.2mL离心管中加人2X One Step RT-PCR 10L，Enzyme Mix 0.6L，BSMVF 00mol/L)O.4L，BSMVRC10mol/L)O.4L，BSMVP C 10mol/L)o.8L，模板RNA2L，补DEPC处理水至20L。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。所有试剂加人均在超净工作台上操作;试剂全部加人后将离心管放置到实时荧光定量PCR仪中进行反应。反应程序:45 o C 10m i n;95 oC 10m i n;95 o C 15 s,60 o C 1 m i n，共45个循环。D.4 结果判定对于疑似分离物，阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性;无典型扩增曲线判定为阴性。对于样品检测，阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线，且CT35，判定为阳性;35CT40，增加核酸用量2倍10倍再次测试，出现典型扩增曲线，且CT35，判定为阳性;其余情况判定为阴性。9-NON-寸-O寸问阁。华人民共国家标准大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法国和中GB/T 40194-2021 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)争夺网址: 服务热线:400-168-0010 2021年5月第一版*回罪田幅画画BN面.回1L:.I飞rJ.li咀咀码上归一归正版服务到书号155066 1-67584 侵权必究版权专有GB/T 40194-2021