《核酸化学》PPT课件 (2).ppt

第三第三 章章 核核 酸化学酸化学 u生物体的分子组成：生物体的分子组成：蛋白质、核酸、糖、脂肪蛋白质、核酸、糖、脂肪四大基本物质。四大基本物质。水和无机盐及其他物质。水和无机盐及其他物质。第三章第三章 核酸化学核酸化学第一节 核酸概述 第二节 核苷酸第三节 核酸的分子结构第四节 核酸的性质及分离提取第一节第一节 核酸概述核酸概述一、核酸的生物学功能二、核酸的种类三、分布四、核酸的化学组成一、核酸的生物学功能一、核酸的生物学功能功能：核酸是活细胞中最关键的组分，它携带着遗传信息，是遗传的物质基础；它决定蛋白质和酶的结构，因此它决定每一种生物体的代谢类型和形态。分子量 RNA：几万几百万 DNA：1.6 x 1062.2 x 109 人的染色体人的染色体唐氏综合征唐氏综合征唐氏综合征又称21三体综合征,先天愚型或Down综合症属常染色体畸变，是小儿染色体病中最常见的一种，活婴中发生率约1（600800），母亲年龄愈大，本病的发病率愈高。60患儿在胎儿早期即夭折流产。唐氏综合征包含一系列的遗传病，其中最具代表性的第21对染色体的三体现象，会导致包括学习障碍、智能障碍和残疾等高度畸形。性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形Klinefetter综合症(先天性睾丸发育不全)外貌男性,睾丸萎缩,具有乳房,不育,低智商 身高183 cm 占1/260;染色体组成:47,XXY 在男性不育中占1/100Klinefetter综合症(先天性睾丸发育不全)性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形Turner综合症Turner综合症（性腺发育不全）外貌女性，个矮（1.3m左右）第二性征发育不良，原发性闭经，肘外翻，盾状胸，35%有心血管病，智力低下或正常.染色体组成：45,X0性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形Turner综合症（性腺发育不全）性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形XYY或多个Y个体XYY或多个Y个体 占男性的1/2501/500，个高（1.80 m以上),外貌男性,病症类似 47,XYY,智力一般较低,性格粗暴,易冲动,生殖器官发育不良,多数不育,有人认为患者有反社会行为.性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形XYY或多个Y个体性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形多X女性多X女性 表现为女性,眼距宽,外生殖器及第二性征多正常,有的月经失调,类似21三体,智力发育迟缓.性染色体与性别畸形性染色体与性别畸形核酸研究的发展简史核酸研究的发展简史1868年年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取从脓细胞中提取“核素核素”1889年年 Altman分离到不含蛋白质的核酸，分离到不含蛋白质的核酸，首次使用首次使用“核酸核酸”一词一词1944年年 Avery等人等人证实证实DNA是遗传物质是遗传物质1953年年 Watson和和Crick发现发现DNA的双螺旋结构的双螺旋结构1968年年 Nirenberg发现发现遗传密码遗传密码1975年年 Temin和和Baltimore发发现现逆转录酶逆转录酶1981年年 Gilbert和和Sanger建建立立DNA 测序方法测序方法1985年年 Mullis发明发明PCR 技术技术1990年年 美国启动美国启动人类基因组计划人类基因组计划(HGP)1994年年 中国人类基因组计划启动中国人类基因组计划启动2001年年 美、英等国美、英等国完成人类基因组计划基本框架完成人类基因组计划基本框架二、核酸的种类二、核酸的种类(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸转运转运RNARNA（tRNAtRNA）信使信使RNA RNA（mRNA）核糖体核糖体RNA RNA（rRNA）三、核酸的分布三、核酸的分布 真核生物真核生物 原核生物原核生物DNA 细胞核细胞核98 细胞质细胞质 质粒质粒 线粒体（少量）线粒体（少量）病毒病毒DNA 叶绿体（少量）叶绿体（少量）RNA 细胞质细胞质90%细胞质细胞质 核仁（少量，）核仁（少量，）病毒病毒RNA四、核酸的化学组成四、核酸的化学组成（一）、元素组成：（一）、元素组成：主要元素组成：主要元素组成：C、H、O、N、P(910%)（二）、构成单位（二）、构成单位 以核苷酸为基本单位构成的。以核苷酸为基本单位构成的。第二节第二节 核苷酸核苷酸一、组成成分一、组成成分二、核苷和核苷酸的形成二、核苷和核苷酸的形成一、组成成分一、组成成分(nucleic acid )组成核酸的戊糖有两种。组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；脱氧核糖；RNA所含的糖则为所含的糖则为-D-核糖。核糖。（一）、戊糖RiboseRiboseDeoxyriboseDeoxyribose1235412354D（二）、碱基（二）、碱基1.嘌呤（嘌呤（Purine）2.嘧啶（嘧啶（Pyrimidine）123456 胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶 （C）（U）(T)3 3、稀有碱基、稀有碱基 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。二、核苷和核苷酸的形成二、核苷和核苷酸的形成（一）、核苷（一）、核苷（nucleoside）核苷 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键 嘌呤N9-H和戊糖C1-0H 嘧啶N1-H和戊糖C1-0H1 1 2 2 3 3 4 4 5 5(OH)1 1 2 2 3 3 4 4 5 5(OH)Adenosine Guanosine Cytidine Uridine酮式烯醇式互变异构胺式亚胺式互变异构稀有核苷稀有核苷连接方式不同稀有戊糖稀有碱基22（二）、核苷酸（nucleotide）核苷+磷酸 （磷酸酯键：戊糖C5-OH与磷酸脱水）HHHHHHH H H核糖核苷酸核糖核苷酸 脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸 核苷酸核苷酸(ribonucleotideribonucleotide)的结构与命名的结构与命名ab核苷酸核苷酸核苷酸衍生物1.1.继续磷酸化继续磷酸化AMPADPATPATP的性质ATP ATP 分子的最显著特点是含有两个分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。高能磷酸键。ATP ATP 是生物体内最重要的能量转换是生物体内最重要的能量转换中间体。中间体。ATP ATP 水解释放出来的能量水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化用于推动生物体内各种需能的生化反应。反应。2.环化磷酸化l cAMPl cGMP3,5-环腺苷酸环腺苷酸3,5-环鸟苷酸环鸟苷酸cAMP(3cAMP(3,5,5-环环 化化 腺腺苷苷酸酸)和和cGMP(3cGMP(3,5,5-环环化化鸟鸟苷苷酸酸)的的主主要要功功能能是是作作为为细细胞胞的的第第二二信信使。使。cAMPcAMP和和cGMPcGMP的的环环状状磷磷酯酯键键是是一一个个高高能能键键。在在pH7.4,pH7.4,cAMPcAMP和和cGMPcGMP的的水水 解解 能能 约约 为为 43.9 43.9 KJ/molKJ/mol，比比ATPATP水水解解能能高得多。高得多。3.3.辅酶辅酶 NADNAD+(辅酶辅酶I,I,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）NADPNADP+（辅酶（辅酶IIII，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）FMN FMN（黄素单核苷酸）（黄素单核苷酸）FAD(FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸）黄素腺嘌呤二核苷酸）CoACoA 辅酶辅酶A A4.4.糖基载体糖基载体 葡萄糖只有与葡萄糖只有与UDPUDP、ADPADP、GDPGDP等核苷酸结合为等核苷酸结合为UDPGUDPG、ADPGADPG、GDPGGDPG等活化形式，才能进一步合成蔗糖和等活化形式，才能进一步合成蔗糖和多糖。多糖。第三节第三节 核酸的结构核酸的结构一、核苷酸的连接方式一、核苷酸的连接方式二、二、DNA的结构的结构三、三、RNA的结构的结构一、核苷酸的连接方式一、核苷酸的连接方式通过一个核苷酸的通过一个核苷酸的C C3 3-OH-OH 与另一分子核苷酸的与另一分子核苷酸的5 5-磷酸基形成磷酸基形成3 3,5,5-磷酸二酯键磷酸二酯键相连而成。相连而成。5533二、二、DNADNA的结构的结构（一）、（一）、DNA的一级结构的一级结构 DNA分子上核苷酸的排列顺序。分子上核苷酸的排列顺序。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。n 信息量：信息量：4nn末端：末端：5 端、端、3 端端n多核苷酸链的方向：多核苷酸链的方向：5端端3端端(由左至右由左至右)DNADNA一级结构的表示方法：一级结构的表示方法：结构式、线条式、字母式结构式、线条式、字母式（c）（b）（二）、（二）、DNADNA的二级结构的二级结构double helix model DNA DNA的双螺旋结构的双螺旋结构p 碱基组成规律碱基组成规律Chargaff 规则：规则：p DNA纤维的纤维的X-光衍射图谱分析光衍射图谱分析 R.Franklin M.Wilkins DNA双螺旋结构的研究背景双螺旋结构的研究背景nA=T，G=C；A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等嘌呤与嘧啶的总数相等)n有种属特异性有种属特异性n无组织、器官特异性无组织、器官特异性n不受年龄、营养、性别及其他环境等影响不受年龄、营养、性别及其他环境等影响DNA X衍射图衍射图1 1、DNADNA双螺旋结构的要点双螺旋结构的要点（1）、DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链构成双螺旋结构。两条链围绕同一个“中心轴”形成右手螺旋，螺旋表面有一条大沟和一条小沟。（2）、嘌呤碱和嘧啶碱层叠于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，碱基之间的堆集距离为0.34nm。磷酸与脱氧核糖在外侧，彼此之间通过磷酸二酯键连接，形成DNA的骨架。糖环平面与中轴平行。（3）、双螺旋的直径为2nm,顺轴方向每隔0.34nm有一个核苷酸，两个核苷酸之间的夹角为36，因此，沿中心轴每转一周有10个核苷酸。（4）、一条多核苷酸链上的嘌呤碱基与另一条链上的嘧啶碱基以氢键相连，匹配成对，配对的原则是A=T，之间形成二个氢键，G三C，之间形成三个氢键。34n（1）主链的走向n（2）各组分的位置n（3）双螺旋的一些数据n（4）碱基配对0.34nm0.34nm3.4nm3.4nm2nm2nm计算机模拟计算机模拟DNA双螺旋结双螺旋结构（蓝色）大构（蓝色）大沟中结合着蛋沟中结合着蛋白质（红色）白质（红色）A T 配对配对G C 配对配对双螺旋侧面图双螺旋侧面图2 2、稳定双螺旋结构的力、稳定双螺旋结构的力（1）碱基堆集力）碱基堆集力 是层层堆集的芳香族碱基上N原子电子云交错而形成的一种力，使双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的水分子隔开，有利于互补碱基间形成氢键，稳定双螺旋结构。（2）氢键）氢键 互补碱基对之间可形成氢键。DNA外侧的氧与介质中的水或蛋白质上的-OH形成。（3）离子键）离子键 磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成离子键，减少双链间的静电排斥力。其中碱基堆集力是碱基堆集力是使DNA结构稳定的最主要最主要因素。3 3、DNADNA二级结构的多态性二级结构的多态性 在多核苷酸链中，脱氧核糖的五员环能折叠成多种构在多核苷酸链中，脱氧核糖的五员环能折叠成多种构象，此外，分子还可绕象，此外，分子还可绕CN糖苷键以及糖苷键以及3，5一磷酸一磷酸二酯键旋转一定的角度，这就使具有同样碱基配对的二酯键旋转一定的角度，这就使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象上这种差构象上这种差异称为多态性。异称为多态性。Watson和和Crick 所描述的所描述的DNA双螺旋构象现在双螺旋构象现在称为称为B型型DNA，另外还有，另外还有A型和型和Z型等构象类型的型等构象类型的DNA，在一定条件下，在一定条件下BDNA可转变为可转变为ADNA或或ZDNA。ADNA：B型（湿度：92%DNA钠盐纤维的构象）DNA脱水时，就转变为A型（湿度：75%DNA钠盐纤维的构象），也是由反向的两条多核苷酸链组成右手螺旋。每一螺圈含11个碱基对，碱基对与水平面的倾角约为20，两个核苷酸之间的夹角为33。RNADNA杂交双链以及RNA双螺旋区具有与ADNA相似的结构。ZDNA：Rich在研究CGCGCG寡聚体结构时，发现CGCGCG有左手螺旋的双螺旋结构，称之为左旋DNA。因为磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈“Z”字型，又称为ZDNA。特点：直径1.8nm，螺距4.5nm，每一螺圈含12个碱基对，整个分子比较细长而伸展，大沟外凸而变得不明显，小沟则窄而深。类型类型旋转方向旋转方向螺旋直径螺旋直径（nm）螺距螺距（nm）每转碱基每转碱基对数目对数目碱基对间垂直碱基对间垂直距离（距离（nm）碱基对与水碱基对与水平面倾角平面倾角ADNABDNAZDNA右右右右左左2.32.01.82.83.44.51110(10.4)120.2550.340.372007 DNA double helix类型类型A型型 B型型 Z型型A型型 B型型 Z型型4、三链DNA多聚（dA）多聚（dT）具有类似BDNA的结构，提高其环境中的盐浓度（或降低相对湿度），它的双螺旋结构就歧化成三链结构和一条多聚脱氧核苷酸链。另外，DNA的polyPupolyPy区段同样可转变为三链结构。DNA的三链结构可能与基因表达调控有关。第三股链的存在可能阻碍了一些调控蛋白或RNA聚合酶与DNA的结合。三链DNA（三）（三）DNADNA的三级结构的三级结构 在细胞中，由于DNA与其它分子（如蛋白质）的相互作用，双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。1、大多数原核生物、大多数原核生物：1 1）共价封闭的环状双）共价封闭的环状双螺旋分子螺旋分子2 2）超螺旋结构：双螺）超螺旋结构：双螺旋基础上的螺旋化旋基础上的螺旋化正超螺旋正超螺旋(positive(positive supercoilsupercoil):):盘绕方向盘绕方向与双螺旋方同相同与双螺旋方同相同负超螺旋负超螺旋(negative(negative supercoilsupercoil):):盘绕方向盘绕方向与双螺旋方向相反与双螺旋方向相反 DNA超螺旋2、真核生物细胞内染色体、真核生物细胞内染色体核小体核小体(nucleosome)：由由DNA和组蛋白构成。和组蛋白构成。DNA：以负超螺旋缠：以负超螺旋缠绕在组蛋白上绕在组蛋白上组蛋白组蛋白核心核心：H2A,H2B,H3,H4H2A,H2B,H3,H4H1H1组蛋白在核小体之间组蛋白在核小体之间DNA的包装染色体染色体三、三、RNARNA的结构的结构RNA的碱基组成没有DNA那样的规律，大多数天然RNA分子是一条单链，其可以发生分子自身回折，而使互补碱基区形成局部双螺旋区，不能配对的碱基区域则形成突环。（一）、（一）、tRNAtRNA的的 二级结构二级结构 和三级结构和三级结构 tRNA一般由四臂四臂四环四环构成：臂：臂：（1）叶柄aa臂，3端：-CCAOH结构，接受氨基酸。（2）左臂（3）右臂（4）反密码子臂环：环：（1）反密码环中间三个核苷酸组成反密码子。（2）额外环（3）DHU环（4）T环（含T序列）额外环额外环tRNA的三级的三级结构结构倒倒L形结构形结构（二）、（二）、mRNAmRNA的结构的结构 mRNA分子也是呈单链状态，大部分有突环形成二级分子也是呈单链状态，大部分有突环形成二级结构结构。真核生物真核生物mRNA的结构有明显特征：的结构有明显特征：在在5末端有一个特殊的末端有一个特殊的5帽子结构：帽子结构：5m7G5PPP5NmP。在在3末端有长约末端有长约200核苷酸的核苷酸的polyA原核生物原核生物mRNA一般无一般无3polyA和和5帽子结构。帽子结构。5帽子结构：帽子结构：5m7G5PPP5NmP原核生物mRNA一般为多顺反子：一条mRNA编码多条多肽链。真核生物mRNA一般为单顺反子：一条mRNA编码一条多肽链。（三）、（三）、rRNArRNA的结构的结构基本上都是由部分双螺旋与部分突环相间排列基本上都是由部分双螺旋与部分突环相间排列而成。而成。16S rRNA 的二级的二级结构结构原核生物（以大肠杆菌为例）原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸个核苷酸18S1874个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质21种种占总重量的占总重量的40%33种种占总重量的占总重量的50%大亚基大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸28S5.8S5S4718个核苷酸个核苷酸160个核苷酸个核苷酸120个核苷酸个核苷酸蛋白质蛋白质31种种占总重量的占总重量的30%49种种占总重量的占总重量的35%核蛋白体的组成核蛋白体的组成*rRNArRNA的功能的功能:组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。第四节第四节 核酸的理化性质核酸的理化性质一、一般性质一、一般性质二、紫外吸收性质二、紫外吸收性质三、变性、复性与分子杂交三、变性、复性与分子杂交一、一般性质提纯的DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，两者都微溶于水微溶于水，不溶于一般有机溶剂不溶于一般有机溶剂。溶液中的核酸在引力场中可以下沉，沉降速度与分子量和分子构象有关。可用超速离心技术测定核酸的沉降常数（当分子颗粒以恒定速度在溶剂中移动时，即净离心力与摩擦力处于平衡时，单位离心力场的沉降速度为定值，称为沉降常数S（Svedberg），1S=10-13秒）和分子量。一、一般性质DNA分子由于直径小而长度大，因此溶液粘粘度极高度极高，RNA分子粘度则小得多。核酸是两性电解质两性电解质，（含碱性基团、磷酸基团），因磷酸的酸性强，常表现酸性。由于核酸分子在一定酸度的缓冲液中带有电荷，因此可利用电泳进行分离和研究其特性。最常用的是凝胶电泳。二、紫外吸收性质二、紫外吸收性质核酸在260nm附近有最大吸收值，据此特性可定性和定量检测核酸和核苷酸。1、天然、天然DNA2、变性、变性DNA3、核苷酸总吸收值、核苷酸总吸收值1.DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50g/ml双链双链DNA33g/ml单链单链DNA40g/ml RNA20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0OD 260/OD280值值1.8，含，含RNA；OD 260/OD280值值1.8时，含蛋白质时，含蛋白质 OD260的应用的应用三、变性、复性与分子杂交三、变性、复性与分子杂交（一）、变性 1、DNA变性（变性（DNA denaturation）：）：DNA变性是指在变性是指在理化因素作用下，理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。过程。DNA变性的本质是双链间氢键的断裂，不涉及磷酸二变性的本质是双链间氢键的断裂，不涉及磷酸二酯键的断裂。酯键的断裂。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；增高；粘度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变。浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变。DNA变性增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液ODOD260260增高的现象。增高的现象。当DNA分子从双螺旋结构变为单链状态时，它在260nm处的紫外吸收值便增大，此现象称为增色效应。2 2、变性因素：、变性因素：热力强酸强碱有机溶剂变性剂射线机械力等。3 3、变性指标：、变性指标：熔解温度（变性温度）（Tm）：变性作用发生在一个很窄的温度范围之内，通常把热变性过程中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度。TmTm与下列因素有关：与下列因素有关：DNA的碱基组成：Tm值与GC含量成正比：核酸的均一程度，均一性愈高的样品，变性过程的温度范围愈小。Tm值与介质离子强度成正比。（二）复性（二）复性变性DNA在适当条件下，又可使彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，全过程称为复性。DNA复性后，许多理化性质、部分生物活性可得到恢复。将热变性DNA骤然降温时，DNA不能复性，只有在缓慢冷却时，才可复性。DNA复性核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少3040%，这是在有规律的双螺旋结构中碱基紧密地堆积在一起造成的，此现象称为DNA的减色效应。的减色效应。（三）分子杂交（三）分子杂交(hybridization)(hybridization)不同来源的DNA分子放在一起热变性，然后慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间有互补或部分互补序列，则复性时会形成“杂交分子”。DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。核酸的杂交Southern blot：DNA与与DNA杂交杂交Northern blot：DNA与与RNA杂交杂交核酸与蛋白质的复合体核酸与蛋白质的复合体生物体内核酸常与蛋白质结合称复合体，称为核蛋白复合体。如：染色体 核糖体 病毒染色体染色体烟草烟草花叶病毒花叶病毒噬菌体噬菌体核糖体核糖体