第3章 培养基成分及配制.ppt

2022/12/271 第三章第三章 培养基及一般操作技术培养基及一般操作技术2022/12/272第一节第一节 培养基的概念、种类和成分培养基的概念、种类和成分第二节第二节 培养基制备培养基制备 第三节第三节 一般操作技术一般操作技术 在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官适合一切类型的植物组织或器官。2022/12/273第一节第一节 培养基的概念、种类和成分培养基的概念、种类和成分 一、概念：培养基（一、概念：培养基（culture mediumculture medium）是人工配制的含）是人工配制的含有各种营养成分，经过严格灭菌的适于植物生长重要基有各种营养成分，经过严格灭菌的适于植物生长重要基质质。在建立一项新的培养系统时，首先必须找在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。着培养基的研制史。2022/12/2742022/12/275不同的植物不同的植物不同培养部位不同培养部位 不同的培养目的不同的培养目的需选用不同需选用不同的培养基的培养基二、培养基的种类二、培养基的种类 培养基多数以发明人的名字来命名，如培养基多数以发明人的名字来命名，如White培养基，培养基，Murashige和和Skoog培养基培养基(简称简称MS培养基培养基)，也有对某些成，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。分进行改良称作改良培养基。2022/12/276 培培养养基基种种类类MS培养基培养基1962B5培养基培养基1968White培养基培养基1937N6培养基培养基1975KM-8P培养基培养基1974Miller培养基培养基1965Nitsch培养基培养基1963WPM培养基培养基1933 1962年年由由Murashige和和Skoog为为培培养养烟烟草草细细胞胞而而设设计的。计的。特点：无机盐离子特点：无机盐离子 浓度高，硝酸盐含量较高浓度高，硝酸盐含量较高 广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养2022/12/277 MS培养基及特点培养基及特点:1968年由年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。等为培养大豆根细胞而设计的。特点：特点：含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑 制作用。制作用。双子叶植物双子叶植物 尤其木本植物组培可选择尤其木本植物组培可选择2022/12/278B B5 5 培养基及特点：培养基及特点：19371937年年由由WhiteWhite为为培培养养番番茄茄根根尖尖而而设设计计的的，19431943年年 随随其其专专著著的的出出版版而而问问世世。19631963年年又又作作了了改改良良，称称作作WhiteWhite改良培养基，提高了改良培养基，提高了MgSOMgSO4 4的浓度和增加了硼素。的浓度和增加了硼素。2022/12/279White 培养基特点：培养基特点：特点：无机盐数量较低特点：无机盐数量较低适于生根培养适于生根培养1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的2022/12/2710N6培养基特点：培养基特点：特点特点;成分较简单，成分较简单，KNO3 和和(NH4)2SO4含量高含量高 适合花药培养适合花药培养 特点：有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素特点：有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素 广泛用于原生质体培养，包括融合的培养广泛用于原生质体培养，包括融合的培养2022/12/2711 KM-8P培养基特点：培养基特点：1974年为原生质体培养而设计的。年为原生质体培养而设计的。2022/12/2712培养基种类培养基种类固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基通气性较好，便于操作，通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长但营养分布不均，生长发育不整齐。发育不整齐。营养分布均匀，生长整营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。齐一致，但通气性差。培养基按是否加入凝固剂分为培养基按是否加入凝固剂分为2022/12/2713 培培养养基基成成分分三、培养基的成分三、培养基的成分水水无机盐无机盐有机物有机物植物激素植物激素培养体的支持材料培养体的支持材料其它辅助性物质其它辅助性物质 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。以防成分的变化引起不良效果。2022/12/2714（一）水（一）水 无机营养成分就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无无机营养成分就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素。它们在植物生活中具有非常重要的作用。机元素。它们在植物生活中具有非常重要的作用。如氮（如氮（N）、硫（）、硫（S）、磷（）、磷（P）是蛋白质、氨基酸、）是蛋白质、氨基酸、核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直接的不可缺少的关系。接的不可缺少的关系。2022/12/2715（二）无机元素（二）无机元素 根根据据植植物物对对这这些些元元素素需需要要量量的的不不同同或或者者根根据据目目前前植植物物培培养养基基中中添添加加的的这这些些元元素素量量的的大大小小，可可将将它它们们分分成成大大量量元元素和微量元素。素和微量元素。大量元素：一般指在培养基中的浓度大于大量元素：一般指在培养基中的浓度大于0.5mmol/L的元的元素（或素（或 100mg/L）。主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六）。主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种。种。微量元素微量元素：指小于指小于0.5mmol/L的元素或的元素或 100mg/L）。）。2022/12/2716大量元素（以大量元素（以MS培养基为例培养基为例）序号序号化学式化学式化学名称化学名称用量用量mg/L1KNO3硝酸钾硝酸钾19002NH4NO3硝酸铵硝酸铵16503KH2PO4磷酸二氢钾磷酸二氢钾1704MgSO4.7H2O硫酸镁硫酸镁3705CaCL2.4H2O二氯化钙二氯化钙440微量元素（以微量元素（以MS培养基为例）培养基为例）序号序号化学名称化学名称化学式化学式用量（用量（mg/L)1碘化钾碘化钾KI0.832硼酸硼酸H3BO36.23硫酸锰硫酸锰MnSO4.4H2O22.34硫酸锌硫酸锌ZnSO4.7H2O8.65钼酸钠钼酸钠Na2MoO4.2H2O0.256硫酸铜硫酸铜CuSO4.5H2O0.0257氯化钾氯化钾CoCL2.6H2O0.0251.1.大量元素大量元素 (1)N:是是蛋蛋白白质质、酶酶、叶叶绿绿素素、维维生生素素、核核酸酸、磷磷脂脂、生生物物碱等的碱等的组组成成分，是生命不可缺少的物成成分，是生命不可缺少的物质质。在在制制备备培培养养基基时时以以硝硝态态氮氮（NO3-N)或或氨氨态态氮氮（NH4-N)两两种种形形式式供供应应。大大多多数数培培养养基基既既含含有有硝硝态态氮氮（NO3-)又又含含有有氨氨态态氮氮（NH4+)。氨氨态态氮氮（NH4-N)对对植植物物生生长长较较为为有有利利。供供应应的的物物质质有有KNO3、NH4NO3等等。有有时时，也也添添加加氨氨基基酸酸来来补补充充氮氮素。素。缺缺氮氮时时某某些些植植物物的的愈愈伤伤组组织织会会出出现现一一种种很很引引人人注注目目的的花花色素苷的色素苷的颜颜色，愈色，愈伤组织伤组织内部不能形成内部不能形成导导管。管。2022/12/2719(2)P 是是磷磷脂脂的的主主要要成成分分，而而磷磷脂脂又又是是原原生生质质、细细胞胞核核的的重重要要组组成部分。磷也是成部分。磷也是ATP、ADP等的等的组组成成分。成成分。在在植植物物组组织织培培养养过过程程中中，向向培培养养基基内内添添加加磷磷，不不仅仅增增加加养养分分、提提供供能能量量，而而且且也也促促进进对对N的的吸吸收收，增增加加蛋蛋白白质质在在植物体中的植物体中的积积累。累。常用的物常用的物质质有有KH2P04或或NaH2P04等。等。缺缺磷磷或或钾钾时时细细胞胞会会过过度度生生长长，愈愈伤伤组组织织表表现现出出极极其其蓬蓬松松状状态态。2022/12/2720 (3)K 对对碳碳水水化化合合物物合合成成、转转移移、以以及及氮氮素素代代谢谢等等有有密密切关系。切关系。K增增加加时时，蛋蛋白白质质合合成成增增加加，维维管管束束、纤纤维维组组织织发发达达，对对胚胚的的分分化化有有促促进进作作用用。但但浓浓度度不不易易过过大大，一一般般为为1-3mgL为为好。好。制制备备培养基培养基时时，常以，常以KCl、KNO3等等盐类盐类形式提供形式提供。2022/12/2721(4)Mg、S和和Ca Mg 是叶是叶绿绿素的素的组组成成分，又是激成成分，又是激酶酶的活化的活化剂剂；S是含是含S氨基酸和蛋白氨基酸和蛋白质质的的组组成成分。成成分。常以常以MgS047H20提供，提供，用量用量为为1-3mgL较为较为适宜；适宜；Ca是是构构成成细细胞胞壁壁的的一一种种成成分分，Ca对对细细胞胞分分裂裂、保保护护质质 膜不受破坏有膜不受破坏有显显著作用著作用 常常以以CaCl22H20提提供供，缺缺硫硫时时培培养养的的植植物物组组织织会会明明显显的退的退绿绿。2022/12/27222.2.微量元素微量元素 微量元素微量元素 包括包括FeFe、MnMn、CuCu、ZnZn、ClCl、B B、MoMo、CoCo等。等。铁铁是是一一些些酶酶（氧氧化化酶酶、细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶、过过氧氧化化氢氢酶酶等等）的重要组成成分，又是叶绿素形成的必要条件的重要组成成分，又是叶绿素形成的必要条件 培培养养基基中中的的铁铁对对胚胚的的形形成成、芽芽的的分分化化和和幼幼苗苗转转绿绿有有促促进进作用作用 但但由由于于FeFe的的特特殊殊性性质质，即即很很不不稳稳定定、易易沉沉淀淀，需需要要在在酸酸性性条条件件下下才才能能比比较较稳稳定定，故故在在培培养养基基配配制制时时常常常常把把FeFe盐盐单单独配制，且以螯合物的形式存在独配制，且以螯合物的形式存在2022/12/2723 B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等等，也也是是植植物物组组织织培培养养中中不不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。Mn对对糖糖酵酵解解中中的的某某些些酶酶有有活活化化作作用用，是是三三羧羧酸酸循循环环中中某某些些酶和硝酸还原酶的活化剂。酶和硝酸还原酶的活化剂。B 能能促促进进糖糖的的过过膜膜运运输输，影影响响植植物物的的有有性性生生殖殖如如花花器器官官的的发发育育和和受受精精作作用用。B还还具具有有抑抑制制有有毒毒的的酚酚类类化化合合物物的的形形成成的的作作用用，改改善善某某些些植植物物组组织织的的培培养养状状况况，缺缺硼硼时时细细胞胞分分裂裂停滞，愈伤表现出老化现象。停滞，愈伤表现出老化现象。2022/12/2724Zn 是是吲吲哚哚乙乙酸酸生生物物合合成成必必需需的的，也也是是谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶、乙乙醇醇脱脱氢氢酶酶等的活化等的活化剂剂。Cu 是是细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶、多多酚酚氧氧化化酶酶等等氧氧化化酶酶的的成成分分，可可影影响响氧化氧化还还原原过过程。程。Mo 是硝酸是硝酸还还原原酶酶和和钼铁钼铁蛋白的金属成分。蛋白的金属成分。2022/12/2725有有机机营营养养成成分分2022/12/2726碳水化合物碳水化合物维生素维生素氨基酸氨基酸肌醇肌醇天然复合物天然复合物椰乳椰乳、水解酪蛋白、水水解酪蛋白、水解乳蛋白、酵母提取物、解乳蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、西红柿汁、胰蛋白胨、西红柿汁、香蕉粉、橘子汁、可可香蕉粉、橘子汁、可可汁汁（三）有机元素（三）有机元素氨基酸和有机附加物（以氨基酸和有机附加物（以MS培养基为例）培养基为例）序号序号化学名称化学名称化学式化学式用量用量(mg/L)1肌醇肌醇C6H12O6.2H2O1002甘氨酸甘氨酸NH2.CH2.COOH23盐酸硫胺素盐酸硫胺素C12H17CLN4OS.HCL0.14盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇C8H11O3N.HCL0.55烟酸烟酸NC5H4COOH0.5 选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等 蔗糖浓度：蔗糖浓度：23%，胚培养为，胚培养为415%高压灭菌部分糖会分解；大生产时可用绵白糖高压灭菌部分糖会分解；大生产时可用绵白糖 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。2022/12/27281.1.碳水化合物碳水化合物2022/12/2729种类：种类：VB1(盐酸硫胺素盐酸硫胺素):促愈伤组织产生，提高活力促愈伤组织产生，提高活力 VB6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇):促根生长促根生长 Vpp(烟酸烟酸):与代谢和胚发育有关与代谢和胚发育有关 Vc (抗坏血酸抗坏血酸):防组织褐变防组织褐变 有时还使用生物素、叶酸、核黄素等。有时还使用生物素、叶酸、核黄素等。浓度：浓度：0.11.0mg/L2.维维生素生素(vitamin)3.3.肌醇（环己六醇）肌醇（环己六醇）2022/12/2730促进糖类物质的相互转化和活性物质作用的发挥促进糖类物质的相互转化和活性物质作用的发挥促进愈伤组织生长以及胚状体和芽的形成促进愈伤组织生长以及胚状体和芽的形成对组织细胞繁殖、分化的促进作用对组织细胞繁殖、分化的促进作用使用浓度使用浓度100 mg/L100 mg/L注：用量过多则促褐变注：用量过多则促褐变 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培培养养基基中中最最常常用用的的氨氨基基酸酸是是甘甘氨氨酸酸，其其他他的的如如精精氨氨酸酸、谷谷氨氨酸酸、谷谷酰酰胺胺、天天冬冬氨氨酸酸、天天冬冬酰酰胺胺、丙丙氨氨酸酸等等也也常常用。用。2022/12/27314.4.氨基酸氨基酸 为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉粉，橘子汁，可物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁等天然复合物以及活性炭，渗透调节剂等。可汁等天然复合物以及活性炭，渗透调节剂等。2022/12/27325.5.天然复合物天然复合物 是是椰椰子子的的液液体体胚胚乳乳。它它是是使使用用最最多多、效效果果最最大大的一种天然复合物。的一种天然复合物。在在愈愈伤伤组组织织和和细细胞胞培培养养中有促进作用。中有促进作用。一一般般使使用用浓浓度度在在1010-2020 2022/12/27331)1)椰乳椰乳 用用黄黄熟熟的的小小香香蕉蕉，加加入培养基后变为紫色。入培养基后变为紫色。对对pHpH值值的的缓缓冲冲作作用用大大。主主要要在在兰兰花花的的组组织织培培养养中中应应用用，对对发发育育有有促进作用。促进作用。浓度：浓度：150-200ml/l150-200ml/l2022/12/27342)2)香蕉香蕉 去去掉掉皮皮和和芽芽后后，加加水水煮煮30min，再再经经过过过过滤滤，取取其其滤滤液液使使用，用，用量为用量为150-200gL 对对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。2022/12/27353)3)马铃薯马铃薯 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸（含有约为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸（含有约20种种氨基酸的混合物），氨基酸的混合物），使用浓度为使用浓度为100-200mgL 受酸和酶的作用易分解。受酸和酶的作用易分解。2022/12/27364)4)水解酪蛋白或水解乳蛋白水解酪蛋白或水解乳蛋白 酵酵母母提提取取液液(YE)(0.01-0.05)，主主要要成成分分为为氨氨基基酸酸和和维生素类；维生素类；麦芽提取液麦芽提取液(001-05)苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。2022/12/27375)5)其他其他 2022/12/2738(四四)植物激素植物激素 植植物物激激素素是是指指自自然然状状态态下下植植物物体体内内合合成成，并并从从产产生生处处运运送送到到别别处处，对对生生长长发发育育产产生生显显著著作作用用的的微微量量（1 1微微摩摩尔尔/升以下）有机物。升以下）有机物。植植物物生生长长调调节节剂剂是是指指一一些些具具有有植植物物激激素素活活性性的的人人工工合成的物质。合成的物质。植物激素（植物生长调节剂）植物激素（植物生长调节剂）1、生长素类：、生长素类：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。等。2、细胞分裂素类：、细胞分裂素类：KT，6-BA，ZT等。等。3、赤霉素类；、赤霉素类；GA1-GA4，GA7，GA9，GA16，GA24，GA25等等4、脱落酸：、脱落酸：ABA5、乙烯、乙烯2022/12/2740植物生长植物生长调节物质调节物质植物激素植物激素植物生长调节剂植物生长调节剂在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉赤霉素素GAGA3 3等等2022/12/2741 1）种）种类类IAANAAIBA2,4D 2）作用）作用诱导诱导愈愈伤组织伤组织形成和根分化，促形成和根分化，促进细进细胞分裂胞分裂 和和伸伸长长生生长长。根根对对生生长长素最敏感，在极低素最敏感，在极低浓浓度下度下(10.5-10.8mgL)就可促就可促进进生生长长，其次是茎和芽。，其次是茎和芽。3）浓浓度度0.055mg/L 天然的生天然的生长长素素热稳热稳定性差，高温高定性差，高温高压压或受光条件易被破或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内坏。在植物体内也易受到体内酶酶的分解。的分解。组织组织培养中常用培养中常用人工合成的生人工合成的生长长素素类类物物质质1 1、生长素类、生长素类IAA(吲哚吲哚乙酸乙酸)是是天天然然存存在在的的生生长长素素，亦亦可可人人工工合合成成，其其活活力力较较低低，是是生生长长素素中中活活力力最最弱弱的的激激素素，对对器器官官形形成成的的副副作作用用小小，高高温温高高压压易易被被破破坏坏，也也易易被被细细胞胞中中的的IAA分分解解酶酶降降解解，受受光光也也易易分解。分解。NAA(萘萘乙酸乙酸)在在组织组织培养中的起培养中的起动动能力要比能力要比IAA高出高出3-4倍，且由于可大倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高批量人工合成，耐高温高压压，不易被分解破坏，所以，不易被分解破坏，所以应应用用较较普遍。普遍。NAA和和IBA广泛用于生根，并与广泛用于生根，并与细细胞分裂素互作胞分裂素互作促促进进芽的增殖和生芽的增殖和生长长。2022/12/2742 IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质是促进发根能力较强的生长调节物质。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)起起动动能能力力比比IAA高高10倍倍，特特别别在在促促进进愈愈伤伤组组织织的的形形成成上上活活力力最最高高，但但它它强强烈烈抑抑制制芽芽的的形形成成，影影响响器器官官的的发发育育。适适宜宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。生生长长素配制可先用少量素配制可先用少量9595酒精助溶。酒精助溶。2,4-D 2,4-D可用可用0.1mol0.1molL L的的NaOHNaOH或或KOHKOH助溶。助溶。生生长长素常配成素常配成1mg/ml1mg/ml的溶液的溶液贮贮于冰箱中于冰箱中备备用。用。2022/12/2743(2)GA(2)GA(赤霉素赤霉素)种种类类：有有2020多多种种，生生理理活活性性及及作作用用的的种种类类、部部位位、效效应应等等各有不同。培养基中添加的是各有不同。培养基中添加的是GA3GA3。作用：促茎伸作用：促茎伸长长，促胚，促胚发发育成植株；打破休眠；育成植株；打破休眠；特特性性：赤赤霉霉素素溶溶于于酒酒精精，配配制制时时可可用用少少量量9595酒酒精精助助溶溶。赤赤霉霉素素不不耐耐热热，高高压压灭灭菌菌后后将将有有7070-100-100失失效效，应应当当采采用用过滤灭过滤灭菌法加入。菌法加入。2022/12/2744(3)(3)细胞分裂素类细胞分裂素类 这这类类激激素素是是腺腺嘌嘌呤呤的的衍衍生生物物，包包括括6-BA6-BA、Kt(kinetinKt(kinetin)、玉米素玉米素ZeZe等。其中等。其中ZeZe活性最强，但非常昂贵，常用的是活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA6-BA。细胞分裂素使用浓度：细胞分裂素使用浓度：0.05-10mg0.05-10mgL L。2022/12/2745在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱诱导导芽芽的的分分化化促促进进侧侧芽芽萌萌发发生生长长。细细胞胞分分裂裂素素与与生生长长素素相相互互作作用用，当当组组织织内内细细胞胞分分裂裂素素生生长长素素的的比比值值高高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促促进进细细胞胞分分裂裂与与扩扩大大。细细胞胞分分裂裂素素多多用用于于诱诱导导不不定定芽芽的分化、茎、苗的增殖，的分化、茎、苗的增殖，抑制根的分化。避免在生根培养时使用。抑制根的分化。避免在生根培养时使用。2022/12/27461、琼脂、琼脂(agar)作用：最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子作用：最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。碳水化合物，本身并不提供任何营养。特性：溶解在热水中，成为溶胶，冷却至特性：溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固即凝固为固体状凝胶。通常所说的体状凝胶。通常所说的“煮化煮化”培养基，就是使琼脂溶培养基，就是使琼脂溶解于解于90以上的热水。以上的热水。浓度：琼脂的用量在浓度：琼脂的用量在6-10gL之间，若浓度太高，培养基之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。若浓度过低，凝固性不好。2022/12/2747(五五)、培养材料的支持物、培养材料的支持物(六六)、其它辅助性物质、其它辅助性物质2022/12/27481.1.抗生物质抗生物质2.2.抗氧化物抗氧化物3.3.活性炭活性炭 种类种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等青霉素、链霉素、庆大霉素等 用量：用量：5-20mgL 作作用用：防防止止菌菌类类污污染染，减减少少培培养养中中材材料料的的损损失失。对对于于刚刚感感染的组织材料，可向培养基中注入染的组织材料，可向培养基中注入5 5-10-10的抗菌素。的抗菌素。注注意意：抗抗生生素素各各有有其其抑抑菌菌谱谱，要要加加以以选选择择试试用用，也也可可两两种种抗抗生生素素混混用用。但但是是应应当当注注意意抗抗生生素素对对植植物物组组织织的的生生长长也也有有抑制作用，抑制作用，使用要慎重使用要慎重。2022/12/27491 1抗生物质抗生物质 酚污染：酚污染：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色。这些物质渗醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。失去分化能力，最终变褐死亡。在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。重。2022/12/27502 2、抗氧化物、抗氧化物 目前还没有彻底完善的办法，只能按不同的实际情况，目前还没有彻底完善的办法，只能按不同的实际情况，加用一些药物，并适当降低培养温度、及时转移到新加用一些药物，并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解，当然像鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解，当然像严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。2022/12/2751 抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及VcVc 用量：用量：50-200mg50-200mgL L的浓度的浓度 方法：方法：洗涤刚切割的外植体洗涤刚切割的外植体 表面表面 或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其其他他抗抗氧氧化化剂剂：二二硫硫苏苏糖糖醇醇、谷谷胱胱甘甘肽肽、硫硫乙乙醇醇、及及二乙基二硫氨基甲酸二乙基二硫氨基甲酸酯酯等。等。2022/12/2752 活活性性炭炭为为木木炭炭粉粉碎碎经经加加工工形形成成的的粉粉沫沫结结构构，有有很很强强的的吸吸附附作作用用，可可以以吸吸附附非非极极性性物物质质和和色色素素等等大大分分子子物物质质，包包括括琼琼脂脂中中所所含含的的杂杂质质，培培养养物物分分泌泌的的酚酚、醌醌类类物物质质以以及及蔗蔗糖糖在在高高压压消消毒毒时时产产生生的的5-5-羟羟甲甲基基糖糖醛及激素等。醛及激素等。2022/12/27533 3、活性炭、活性炭 使用浓度使用浓度通常为通常为0.5-1mgL 作作用用吸吸附附外外植植体体产产生生的的致致死死性性褐褐化化物物（初初代代培培养养）促促进进新新梢梢的的形形成成和和伸伸长长（新新梢梢增增殖殖阶阶段段），但但其其作作用用有有一一个个阀值，一般为阀值，一般为0.1-0.2。促促进进生生根根（通通过过减减弱弱光光照照保保护护了了IAA），由由于于根根的的生生长长加加快快，吸收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。吸收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。活性炭可降低玻璃苗的产生频率，使用浓度一般活性炭可降低玻璃苗的产生频率，使用浓度一般0.3。2022/12/2754 每每毫毫克克的的活活性性炭炭能能吸吸附附100ng100ng左左右右的的生生长长调调节节物物质质，这这说说明明只只需需要要极极少少量量的的活活性性炭炭就就可可以以完完全全吸吸附附培培养养基基中中的的调调节节物质。物质。大大量量的的活活性性炭炭加加入入会会削削弱弱琼琼脂脂的的凝凝固固能能力力，因因此此，在在使使用时要有其量的意识用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用。使活性炭发挥其积极作用。2022/12/2755 活性炭具有副作用，研究表示活性炭具有副作用，研究表示按性质分按性质分 基本培养基基本培养基：MS、MT（Murashige and Tucher）White 完全培养基完全培养基 基本培养基基本培养基 其它成分（激其它成分（激素、有机物质等）素、有机物质等）第二节第二节 培养基的制备培养基的制备一、合适培养基的一、合适培养基的选择选择合适培养基的合适培养基的选择选择：基本培养基；：基本培养基；各种激素的各种激素的浓浓度与配比度与配比MS 培养基适合于大多数双子叶植物；培养基适合于大多数双子叶植物；B5和和N6 培养基适合于培养基适合于许许多多单单子叶植物；子叶植物；White 培养基适合于根的培养。培养基适合于根的培养。首首先先试试用用这这些些培培养养基基进进行行初初步步实实验验，在在基基本本培培养养基基确确定定之之后后，进进行行不不同同种种类类激激素素浓浓度度和和激激素素间间相相互互比比例例的的配配合合试验试验。2022/12/2757 在植物组织培养工作中，通常先配制一系列母液，在植物组织培养工作中，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。还便于低温保藏。2022/12/2758二、母液的配制二、母液的配制2022/12/2759 称称 量量 母液分装母液分装确定培养基确定培养基 溶溶 解解 定定 容容 贴标签贴标签保存于冰箱保存于冰箱(一一)母液配制流程图母液配制流程图2022/12/2760 一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-100倍。倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。铁盐、有机物和激素类等。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。稀释。(二二)母液配制要求母液配制要求(以以MS为例为例)：具体要求：具体要求：(1)大量元素母液大量元素母液 可配成浓度可配成浓度20倍母液。倍母液。(2)微量元素母液微量元素母液 可配成浓度可配成浓度1000倍的母液。倍的母液。(3)铁盐母液铁盐母液 可配成可配成100倍的母液，倍的母液，(4)有机物母液有机物母液 可配成可配成100倍的母液。倍的母液。(5)激激素素母母液液的的配配制制 每每种种激激素素必必须须单单独独配配成成母母液液，浓浓度度一一般般配配成成1mgml。用用时时根根据据需需要要取取用用。因因为为激激素用量较少，一次可配成素用量较少，一次可配成50ml或或100ml。2022/12/2761IAA、IBA、GA溶于少量的溶于少量的95的酒精的酒精 加水定容；加水定容；NAA 热热水或少量水或少量95的酒精的酒精 加水定容；加水定容；2,4-D可用少量可用少量1mol NaOH溶解溶解 加水定容；加水定容；Kt和和BA 少量少量1mol的的HCI中中 加水定容；加水定容；玉米素玉米素 于少量于少量95的酒精的酒精 加加热热水到一定水到一定浓浓度。度。配配制制好好的的母母液液瓶瓶上上应应分分别别贴贴上上标标签签，注注明明母母液液名名称称、配制倍数、日期及配配制倍数、日期及配1L培养基培养基时应时应取的量。取的量。2022/12/2762激素溶解方法：激素溶解方法：MS母液（储备液）的配制与保存母液（储备液）的配制与保存 成成 分分 用用 量量(g/l)每升培养基取用量每升培养基取用量(ml)母液母液1（大量元素（大量元素 20）NH4NO3KNO3 MgSO4.7H2OCaCL2.2H2OKH2PO4母液母液2（微量元素（微量元素 1000）KIH3BO3MnSO4.4H20ZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCL2.6H2O33387.48.83.40.826.222.38.60.250.0250.02550 成成 分分用量（）用量（）每升培养基用量（）每升培养基用量（）母液母液3（铁盐（铁盐 100）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O2.783.73 10母液母液4（维生素、氨基酸（维生素、氨基酸100）肌醇肌醇烟酸烟酸盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇盐酸硫胺素盐酸硫胺素甘氨酸甘氨酸50.0250.0250.0050.1 10三、培养基的制备三、培养基的制备2022/12/2765移母液移母液调调PH值值培养基熬制培养基熬制灭菌灭菌称取蔗糖、琼脂称取蔗糖、琼脂扎口扎口定容定容分装分装二次定容二次定容接种接种确定配方确定配方 母液移取：一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，母液移取：一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。不滴不漏，吹净为度。2022/12/2766 大量元素母液大量元素母液 取取50ml 微量元素母液微量元素母液 取取1ml 铁铁 盐母液盐母液 取取 10ml 有机物母液有机物母液 取取10ml培养基的配制培养基的配制1 1、在洁净的不锈钢锅里放入、在洁净的不锈钢锅里放入750ml750ml蒸馏水，加入所蒸馏水，加入所需要的琼脂和糖，加热熔化。需要的琼脂和糖，加热熔化。2 2、加入储备液、加入储备液1 1，2 2，储备液，储备液2 2、各、各1 1，1010，1010，按需要量加入植物激素。，按需要量加入植物激素。3 3、用蒸馏水定容到、用蒸馏水定容到1L1L。4 4、调、调pHpH值。值。pHpH一般一般5.85.85 5、培养基的分装。、培养基的分装。6 6、包扎。、包扎。7 7、培养基的高压灭菌、培养基的高压灭菌。取蒸馏水定容到取蒸馏水定容到750ml750ml取蔗糖取蔗糖252530g30g，琼脂琼脂7 78g8g。2022/12/27681.1.称取蔗糖、琼脂称取蔗糖、琼脂2.2.培养基熬制：培养基熬制：2022/12/2769(1).(1).将加入称好的蔗糖和琼脂培将加入称好的蔗糖和琼脂培养液倒入铝锅中，边煮边搅拌，养液倒入铝锅中，边煮边搅拌，防止糊底。用旺火煮开，再用文防止糊底。用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。火加热，直至琼脂全部融化。(2).(2).加入各种储备液，定容至加入各种储备液，定容至1L,1L,摇晃使均匀。摇晃使均匀。3.调调pH值：值：2022/12/2770用用0.1MNaOH或或HCl调调pH值值 为为5.8趁趁热热分装，分装，100ml的三角瓶的三角瓶约约装入装入3040ml，25瓶瓶/L，加盖封口。加盖封口。培养基的灭菌培养基的灭菌 培养基应及时（培养基应及时（24h以内）灭菌，防止变质。以内）灭菌，防止变质。高温高压蒸汽灭菌：高温高压蒸汽灭菌：121，1.1Kg/c，15-20min，时间过长，培养基成分易变性失效，时间过长，培养基成分易变性失效 过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类2022/12/2772 培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间容器的体积容器的体积/mL在在121灭菌所需最少时间灭菌所需最少时间/min20-501575-15020500251000301.1.常见的培养基种类有哪些？各有何特点？专为什么材常见的培养基种类有哪些？各有何特点？专为什么材料的培养而设计的？料的培养而设计的？2.2.培养基的成分主要包括有哪些？培养基的成分主要包括有哪些？3.3.培养基中常用的植物激素有哪些？各有何作用？培养基中常用的植物激素有哪些？各有何作用？4.4.合适培养基的选择应考虑哪些方面？合适培养基的选择应考虑哪些方面？2022/12/2773复习思考题复习思考题