实验九_过氧化氢酶(CAT)活性的测定.ppt

实验九 过氧化氢酶的活性测定过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法紫外吸收法v原原理：理：v H2O2在在240nm波长下有强烈吸收，过氧波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。材料与设备 实验材料实验材料:海桐叶海桐叶实实验验器器材材：紫紫外外分分光光光光度度计计；离离心心机机；研研钵钵；0.5ml刻刻度度吸吸管管2支支，2ml刻刻度度吸吸管管1支支；10ml试管试管3支；恒温水浴；支；恒温水浴；试试 剂剂：O.1mol/LO.1mol/L过过氧氧化化氢氢；，0.1mo1/L0.1mo1/L磷磷酸酸缓冲液缓冲液,pH7.0pH7.0、pH7.8pH7.8 操作步骤：1 1 称称 取取 植植 物物 材材 料料 0.30.3g g，加加 入入，0.1mo1/L0.1mo1/L磷磷酸酸缓缓冲冲液液 (pH7.0)(pH7.0)6ml6ml(分分三三次次加加入入，最最后后两两次次用用于于洗洗研研钵钵)，在在研研钵钵中中研研磨磨成成匀匀浆浆，以以 6000r6000rmin min 离离心心1515分分钟钟，倾倾出上清液。出上清液。操作步骤：2.测测定定：取取10ml试试管管3支支，其其中中2支支为为样样品品测测定定管，管，1支为空白管，按下表顺序加入试剂。支为空白管，按下表顺序加入试剂。紫外吸收法紫外吸收法测测定定H H2 2O O2 2样样品液配置表品液配置表管 号S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水(ml)1.01.01.0操作步骤：3 3测定测定v 25预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测2min，记录数据。4.按下式计算酶活性。结结果果计计算：算：以以1min1min内内A A240240减少减少0.10.1的的酶酶量量为为1 1个个酶酶活活单单位（位（u u）。）。过过氧化氧化氢氢酶酶活性活性(u/gFW/min)=(u/gFW/min)=式中：式中：A240=AS0-A AS0S0加入煮死加入煮死酶酶液的液的对对照管吸光照管吸光值值；A AS1S1,A,AS2S2样样品管吸光品管吸光值值；VtVt粗粗酶酶提取液提取液总总体体积积（mlml）；）；V V1 1测测定用粗定用粗酶酶液体液体积积（mlml）；）；FWFW样样品品鲜鲜重（重（g g）；）；0.1A0.1A240240每下降每下降0.10.1为为1 1个个酶酶活活单单位（位（u u）；）；tt加加过过氧化氧化氢氢到最后一次到最后一次读读数数时间时间（minmin）。）。作 业：1.写实验报告写实验报告2.问题：问题：（1）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?（2）过氧化氢酶与哪些生化过程有关）过氧化氢酶与哪些生化过程有关?