实验二溶血空斑meng.ppt

实验二实验二n n血清分离（眼球取血）血清分离（眼球取血）血清分离（眼球取血）血清分离（眼球取血）n n脾细胞制备脾细胞制备脾细胞制备脾细胞制备(吹气球法吹气球法吹气球法吹气球法)n n溶血空斑试验溶血空斑试验溶血空斑试验溶血空斑试验血清分离血清分离n n眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在眼球采血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量每次采血量每次采血量每次采血量0.6-0.1mL0.6-0.1mL0.6-0.1mL0.6-0.1mL。【操作方法操作方法】n n眼球采血将血液保存于眼球采血将血液保存于眼球采血将血液保存于眼球采血将血液保存于1.5mlEp1.5mlEp1.5mlEp1.5mlEp管中，管中，管中，管中，n n4 4 4 4 静置静置静置静置24H24H24H24H 10000rpm/10min 10000rpm/10min 10000rpm/10min 10000rpm/10min，收集血清；，收集血清；，收集血清；，收集血清；n n-20-20-20-20保存待抗体水平检测。同时采集正常小保存待抗体水平检测。同时采集正常小保存待抗体水平检测。同时采集正常小保存待抗体水平检测。同时采集正常小鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。鼠血清作为对照。小鼠小鼠B B细胞溶血空斑形成试验细胞溶血空斑形成试验n溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于胞的一种体外试验方法，经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。检查动物的抗体产生功能。n n将绵羊红细胞（将绵羊红细胞（将绵羊红细胞（将绵羊红细胞（SRBCSRBCSRBCSRBC）免疫过的小鼠脾细胞）免疫过的小鼠脾细胞）免疫过的小鼠脾细胞）免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，制成细胞悬液，与一定量的绵羊红细胞混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的在补体参与下，使抗体产生细胞周围的在补体参与下，使抗体产生细胞周围的在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBCSRBCSRBCSRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定用于测定用于测定用于测定B B B B细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。细胞抗体产生能力。【试剂与器材试剂与器材】1.1.健康小鼠（约健康小鼠（约181820 20 克重）。克重）。2.2.绵羊红细胞悬液（绵羊红细胞悬液（2.5%2.5%）。）。3.3.指示细胞悬液：指示细胞悬液：含含10%10%绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液 0.5ml0.5ml，补体（即新鲜豚鼠血清），补体（即新鲜豚鼠血清）0.3ml0.3ml，HanksHanks 液液2.0ml2.0ml。4.4.HanksHanks 液（液（pH7.2pH7.2）。）。5.5.动物解剖器械、注射器（动物解剖器械、注射器（5ml5ml）、平皿、中）、平皿、中 试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、6.6.盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。【操作方法操作方法】n免疫动物n取2.5%绵羊红细胞悬液2ml，无菌操作注射于小鼠腹腔内。（4 天后追加一次免疫效果更佳）。n n见试验一，已做见试验一，已做制备脾细胞悬液制备脾细胞悬液1.1.将将免免疫疫后后7 7 天天的的小小鼠鼠颈颈椎椎脱脱位位处处死死，75%75%75%75%乙乙乙乙醇醇醇醇浸浸浸浸泡泡泡泡3 3 3 3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；2.2.2.2.在在在在小小小小鼠鼠鼠鼠左左左左腹腹腹腹侧侧侧侧中中中中部部部部剪剪剪剪开开开开小小小小口口口口，撕撕撕撕开开开开皮皮皮皮肤肤肤肤，暴暴暴暴露露露露腹腹腹腹壁壁壁壁，可见红色长条状脾脏；可见红色长条状脾脏；可见红色长条状脾脏；可见红色长条状脾脏；3.3.3.3.在在在在脾脾脾脾脏脏脏脏下下下下侧侧侧侧提提提提起起起起腹腹腹腹膜膜膜膜，剪剪剪剪开开开开后后后后上上上上翻翻翻翻，暴暴暴暴露露露露脾脾脾脾脏脏脏脏，用用用用镊镊镊镊子子子子提提提提起起起起脾脾脾脾脏脏脏脏，眼眼眼眼科科科科剪剪剪剪分分分分离离离离脾脾脾脾脏脏脏脏下下下下面面面面的的的的结结结结缔缔缔缔组组组组织织织织，取出脾脏。放入盛有取出脾脏。放入盛有取出脾脏。放入盛有取出脾脏。放入盛有5ml Hanks 5ml Hanks 5ml Hanks 5ml Hanks 液的培养皿中；液的培养皿中；液的培养皿中；液的培养皿中；4.4.4.4.左左手手持持一一把把小小镊镊子子夹夹住住脾脾脏脏，右右手手用用5ml 5ml 的的注注射射器器抽抽取取平平皿皿内内液液体体(4(4ml)ml)缓缓缓缓注注入入脾脾脏脏内内，将将脾脾细细胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。胞冲洗出来。如此反复冲洗，到脾脏变白为止。5.5.用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用注射器将脾细胞悬液吸出移入试管中，再用少量用少量HanksHanks 液冲洗脾脏及平皿内残留的液冲洗脾脏及平皿内残留的细胞，移入试管内。离心细胞，移入试管内。离心1000 1000 转转/分分5 5 10 10 分分,弃上清，加弃上清，加5ml 5ml 冷红细胞裂解液（冷红细胞裂解液（NHNH4 4Cl Cl 3.735g/450ml 3.735g/450ml 双蒸水双蒸水+TrisTris 1.3g/50ml 1.3g/50ml 双蒸双蒸水水pH7.65pH7.65），将细胞离心管插入碎冰中，每），将细胞离心管插入碎冰中，每2 2 分钟摇动分钟摇动1 1 次，裂解次，裂解10 10 分。离心（分。离心（10001000转转/分）分）5 510 10 分。弃上清，用分。弃上清，用HanksHanks 液洗液洗2 2 次，离心（次，离心（1000 1000 转转/分）分）5 51010分钟。弃上清。分钟。弃上清。用用用用HanksHanksHanksHanks悬浮细胞，调细胞浓度到悬浮细胞，调细胞浓度到悬浮细胞，调细胞浓度到悬浮细胞，调细胞浓度到2l02l02l02l06 6 6 6/m1/m1/m1/m1。6.6.将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。将沉积的红细胞用乳头吸管吹吸悬起混匀。吸取此悬液吸取此悬液0.1ml 0.1ml 放小试管中，再加放小试管中，再加0.9mlHanks 0.9mlHanks 液，即为液，即为500 500 倍稀释的脾细胞倍稀释的脾细胞悬液。悬液。n n眼球取血眼球取血眼球取血眼球取血 处死小鼠处死小鼠处死小鼠处死小鼠 取脾取脾取脾取脾用用用用10ml10ml10ml10ml洗洗洗洗液冲脾液冲脾液冲脾液冲脾离心离心离心离心2000r/min 8min2000r/min 8min2000r/min 8min2000r/min 8min弃上清，加弃上清，加弃上清，加弃上清，加裂解液裂解液裂解液裂解液2ml2ml2ml2ml，混匀，混匀，混匀，混匀，2min2min2min2min后离心（转数、时间后离心（转数、时间后离心（转数、时间后离心（转数、时间同上）同上）同上）同上）弃上清加洗液弃上清加洗液弃上清加洗液弃上清加洗液10ml10ml10ml10ml，混匀，离心，混匀，离心，混匀，离心，混匀，离心（同上）（同上）（同上）（同上）n n 弃上清加弃上清加弃上清加弃上清加4.9ml4.9ml4.9ml4.9ml洗液混匀洗液混匀洗液混匀洗液混匀n n取取取取0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml脾细胞悬液脾细胞悬液脾细胞悬液脾细胞悬液+0.9ml+0.9ml+0.9ml+0.9ml洗液（洗液（洗液（洗液（A A A A液），混液），混液），混液），混匀匀匀匀n n n n 取取取取0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml（A A A A液）液）液）液）+0.1ml+0.1ml+0.1ml+0.1ml指示系统，混匀指示系统，混匀指示系统，混匀指示系统，混匀n n n n 取取取取50ul50ul50ul50ul加入玻片小室（约用加入玻片小室（约用加入玻片小室（约用加入玻片小室（约用30ul30ul30ul30ul）细胞计数板细胞计数板（HemacytometerHemacytometer）n n血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。进行。进行。进行。n n计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成方格分成方格分成方格分成16161616个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成个中方格，而每个中方格又分成25252525个小方格；另一种是一个大方格分成个小方格；另一种是一个大方格分成个小方格；另一种是一个大方格分成个小方格；另一种是一个大方格分成25252525个中方个中方个中方个中方格，而每个中方格又分成格，而每个中方格又分成格，而每个中方格又分成格，而每个中方格又分成16161616个小方格。但无论个小方格。但无论个小方格。但无论个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即格数都是相同的，即格数都是相同的，即格数都是相同的，即1625=4001625=4001625=4001625=400小方格。小方格。小方格。小方格。示意图示意图细胞计数板的使用细胞计数板的使用ABDC1mm1mm1ml=1cm3=1000mm3细胞数细胞数=A+B+C+D4 104 稀释倍数稀释倍数Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 4 squares/4)X 104细胞数细胞数=A+B+C+D4 104 稀释倍数稀释倍数红细胞计数红细胞计数Concentration/ml=(Dilution Factor)(Count in 5 squares X5)X 104加样加样10ul 10ul 10ul 10ul 细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液玻片小室的制作玻片小室的制作取洁净的载玻片按下图贴二条宽约取洁净的载玻片按下图贴二条宽约5mm 5mm 和一条和一条10mm 10mm 的双面胶，然后用小镊子取的双面胶，然后用小镊子取二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，二片盖玻片分别放在其上，做成两个小室，用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。用小镊子尾部将盖玻片压平贴牢。细胞混悬液的配制及灌注细胞混悬液的配制及灌注1.1.取小试管一支，用取小试管一支，用1ml1ml吸管取吸管取0.2ml0.2ml指示指示细胞悬液；细胞悬液；0.2ml 5000.2ml 500倍稀释的脾细胞倍稀释的脾细胞悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。悬液，混匀后即为被检的细胞混合悬液。2.2.用用100l100l的微量进样器吸取被检细胞混的微量进样器吸取被检细胞混合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两合悬液，于小室一端轻轻将液体注满两个小室。记录实际注入的悬液微升数。个小室。记录实际注入的悬液微升数。3.3.将做好的标本水平放置将做好的标本水平放置3737温箱中，温箱中，孵育孵育30 30 分。分。【结果分析结果分析】结果观察及溶血空斑计数。结果观察及溶血空斑计数。1.1.肉眼观察空斑肉眼观察空斑 ，计数两个小室出现的溶血空，计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检斑数。对模糊不清的空斑，可在低倍镜下检查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴查。真正的溶血空斑，必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。细胞，周围为透明区。2.2.计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：计算出全脾脏中抗体产生细胞总数：脾细胞悬液总毫升数（即为脾细胞悬液总毫升数（即为50ml50ml）抗体产生细胞总数抗体产生细胞总数 标本出现的空斑数标本出现的空斑数注入小室内的脾细胞毫升数注入小室内的脾细胞毫升数溶血空斑试验现象溶血空斑试验现象