动物细胞大规模培养方法及其应用(1).ppt

Section 4：Scaling-up of cell culture动物细胞的大动物细胞的大规模培养规模培养 动物细胞大规模培养技术失建立在贴壁培养法动物细胞大规模培养技术失建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、填和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。展起来的。主要包括：主要包括：悬浮培养悬浮培养微载体培养微载体培养微囊化培养微囊化培养中空纤维法中空纤维法利用大规模培养哺乳类细胞是一项重要的生产生物制品的技术，包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单抗等，具有很高的经济和社会效益。1、悬浮培养、悬浮培养 动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。动物细胞没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅起来的。动物细胞没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气。拌和通气。对于小规程培养多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培对于小规程培养多采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。养多采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养，设备结构简单，有成熟的理论计算，可悬浮培养，设备结构简单，有成熟的理论计算，可以借鉴微生物发酵的部分经验，放大效应小。以借鉴微生物发酵的部分经验，放大效应小。但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫有潜在致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫强力。此外，强力。此外，有许多动物细胞属于贴壁依赖性的，有许多动物细胞属于贴壁依赖性的，不能悬浮培养。不能悬浮培养。悬浮培养的悬浮培养的关键是要选择适当的搅拌和通气关键是要选择适当的搅拌和通气装置装置.2 2、微载体培养系统、微载体培养系统 贴壁依赖性动物细胞的培养，最初是采用滚瓶系统，其结构贴壁依赖性动物细胞的培养，最初是采用滚瓶系统，其结构简单、投资少，技术成熟，重现性好，放大只是简单地增加该瓶简单、投资少，技术成熟，重现性好，放大只是简单地增加该瓶数。但是，滚瓶系统劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面数。但是，滚瓶系统劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面积小。为了克服这些不利因素，积小。为了克服这些不利因素，1967年，年，van wezell开发了微载开发了微载体系统培养贴壁依赖性细胞。体系统培养贴壁依赖性细胞。微载体是直径为微载体是直径为60250 m的的微珠。采用微裁体系统培养动物细胞，细胞贻壁于微载微珠。采用微裁体系统培养动物细胞，细胞贻壁于微载体上，微载体体上，微载体(和细胞和细胞)悬浮于培养基中，细胞在微载体悬浮于培养基中，细胞在微载体表面逐渐生长成单层。表面逐渐生长成单层。1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。微载体是直径60-250m的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。这种模式，把单层培养和悬浮培养的优点融汇在这种模式，把单层培养和悬浮培养的优点融汇在一起，具有两种培养方法的优点。一起，具有两种培养方法的优点。1)表面积体积比大表面积体积比大 2)由于微裁体悬浮于培养基中，是均匀悬浮由于微裁体悬浮于培养基中，是均匀悬浮 培养，培养，简化了细胞生长各种环境因素的监测和控制。简化了细胞生长各种环境因素的监测和控制。3)培养基利用率高。培养基利用率高。4)采样重演性好。采样重演性好。5）收获过程不复杂。）收获过程不复杂。6)放大较容易。放大较容易。7)劳动强度小，占用空间小劳动强度小，占用空间小与微载体结合的生物反应器系统收获细胞接种球传球3、包埋培养、包埋培养 悬浮生长和对贴壁依赖生长的细胞都适用，细悬浮生长和对贴壁依赖生长的细胞都适用，细胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对悬胞生长的密度高，抗剪切力和抗污染能力强。对悬浮生长的细胞用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖生长细浮生长的细胞用海藻酸钙包埋，对贴壁依赖生长细胞用胶原包埋。由于动物细胞培养慢而费有高，且胞用胶原包埋。由于动物细胞培养慢而费有高，且对剪切力敏感，对剪切力敏感，经包埋后可有效的保护细胞。经包埋后可有效的保护细胞。4、微囊化培养微囊化培养 在动物细胞微囊化的制备中，主要是应用海藻酸在动物细胞微囊化的制备中，主要是应用海藻酸聚氨基聚氨基酸的方法，简单过程是动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过酸的方法，简单过程是动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后再用聚微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后再用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内氨基酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除微球内的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。动物细胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是关键材料。中。动物细胞的微囊化中海藻酸和聚氨基酸是关键材料。微囊化方法能使细胞处于相对稳定、受剪切力小的环境中，微囊化方法能使细胞处于相对稳定、受剪切力小的环境中，而养分和氧又可以从微囊外的培养液扩散进入。而养分和氧又可以从微囊外的培养液扩散进入。5、中空纤维培养系统中空纤维是聚砜或丙烯的聚合物制成，一个培养筒内由数千根中空纤维所组成，然后封存在特制的圆筒中，组成的培养系统。每根纤维管内成为“内室”，可灌流无血清培养液供细胞生长；管与管之间称为“外室”。接种的细胞就贴在管壁上，并吸取“内室”渗透出来的养分，迅速生长繁殖。中空纤维培养系统自学：自学：1000L气升式细胞反应器气升式细胞反应器 系统系统中空纤维反应器：左右两箭头为无菌空气进出口。细胞中空纤维反应器：左右两箭头为无菌空气进出口。细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维中外表面。生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维中外表面。典型动物细胞培养反应器典型动物细胞培养反应器 A 中空纤维反应器（贴壁反应器）中空纤维反应器（贴壁反应器）其中关键的是一个笼式撑拌器。笼式通气装置的特点主要是可以避免在向培养基中通气时，气泡不会直接损伤细胞。（因为气泡已被上部的200目丝网机械的破坏了。同时，在采用微教体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生泡沫所裹抉在气液界面。导流筒随搅拌同步转动（3060rpm)时，由于离心力的作用，使搅拌器中心管内产生负压，迫使搅拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从三导流筒口排出，绕搅拌器外缘螺旋下降，培养基和悬浮的细胞或附着细胞或微载体反复循环。由流体搅拌加流体循环，使反应器内流体混和相当好。B、气腔式反应器（悬浮培、气腔式反应器（悬浮培养或微载体培养用养或微载体培养用:搅拌器搅拌器形式之一）形式之一）无泡搅拌反应器是一种装有膜搅拌器的生物反应器，这种反应器的开发和应用在生产中同时解决了通气和均相化的要求。无泡搅拌反应器采用多孔的疏水性的塑料管装配成通气搅拌桨。由于选用多孔塑料管具有良好的氧通透性，从而实现无泡通气搅拌。由于这类反应器能提供动物细胞生长中所需的溶氧要求，产生的剪切力较小以及在通气中不产生泡沫，避免了在其它反应器中常见的某些弱点，如泡队等，因而己广泛地应用于实验室研究和中试工业生产。膜由聚丙烯或其它材料制成，它被加工成多孔的管。在多孔管内的气体压力不能超过鼓泡压力，即气泡在膜外表面出现的静止内压。对于不湿润的硫水膜，相对于水的气泡压力约在13X10Pa。上述这一要求是容易实现的，即加在管上的压力应比管内流动压力降和气泡压力的总和高出10。在那种情况下，就可以形成管外的气掖界面层。即使当多孔管运动时单独的气泡不出现，其传质的情况基本上与气体鼓泡相似。C 膜搅拌器膜搅拌器(悬浮培养或微载体培养用悬浮培养或微载体培养用:搅拌器型式之二搅拌器型式之二)D 流化床反应器（悬浮培养流化床反应器（悬浮培养或微载体培养用或微载体培养用搅拌器形式搅拌器形式三）三）流化床反应器的基本原理就是使支持细胞生长的微粒呈流态化。右图所示为由胶原制成的微粒直径约500 m，具有像海绵一样的多孔性用非毒性物质增加其比重使之达到16或更高，以便它在高速向上流动的培养波中里流态化。细胞就接种于这种微粒之中，通过反应器垂直向上循环流动的培养液使之成为流化床，并不断提供给细胞必要的营养成分，细胞得以在微粒中生长。同时，新鲜培养浪不断地披加入，而培养产物或代谢产物又不断地被排除。这种反应器传质性能很好，并在循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供给高密度细胞所需的氧，同时排除代谢产物如二氧化碳(c02)。反应器中的液体流速能足以使细胞微粒悬浮，却不会损坏脆弱的细胞；培养的细胞密度同且细胞长时间停留在反应器中，细胞生长环境可方便地调控。对贴壁与非贴壁细胞均适用。放大也容易。动物细胞培养应用1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺细胞和狂犬病毒的培养工艺DMEM培养基培养基胎牛血清胎牛血清其他成分其他成分锥形瓶逐级锥形瓶逐级放大培养放大培养加碱（碳酸加碱（碳酸氢钠）氢钠）加糖（葡萄加糖（葡萄糖）糖）灌注培养液灌注培养液微载体微载体5L种子罐培种子罐培养养培养液培养液50L生生物物反反应应器器接种狂犬接种狂犬病毒病毒出液口出液口收获病毒收获病毒动物细胞培养生产具有重要医用价值的动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等酶、生长因子、疫苗和单抗等 大规模动物细胞培养的问题及对策大规模动物细胞培养的问题及对策 1、优化细胞培养环境、优化细胞培养环境2、改变细胞特性、改变细胞特性3、提高产品的产率、提高产品的产率 1、细胞培养环境、细胞培养环境细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。2、细胞死亡与凋亡、细胞死亡与凋亡在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡/死亡多是死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一种种“细胞静止细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高谢毒物产生，提高CHO细胞的目的蛋白产率。细胞的目的蛋白产率。方法是向方法是向CHO细胞中导入细胞中导入p21、p27的基因，使细胞的基因，使细胞周期中周期中G1期延长期延长(细胞静止细胞静止)，改造后，细胞活力正常，改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。产量提高，遗传一致性高。3、培养基与细胞系无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。自的无血清培养基构成。4、过程监控大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，在线过程监控更为重要。