基因诊断与基因治疗2623.docx

基因诊断断与基因因治疗基因诊断断与基因因治疗能能够在比比较短的的时间从从理论设设想变为为现实，主主要是由由于分子子生物学学的理论论及技术术方法，特特别是重重组DNNA技术术的迅速速发展，使使人们可可以在实实验室构构建各种种载体、克隆及及分析目目标基因因。所以以对疾病病能够深深入至分分子水平平的研究究，并已已取得了了重大的的进展。因此在在20世世纪700年代末末诞生了了基因诊诊断(ggenee diiagnnosiis)；随后于于19990年美美国实施施了第一一个基因因治疗(genne ttherrapyy)的临临床试验验方案。可见，基基因诊断断和基因因治疗是是现代分分子生物物学的理理论和技技术与医医学相结结合的范范例。· 基因诊断断 o 基因诊断断的含义义 传统对疾疾病的诊诊断主要要是以疾疾病的表表型改变变为依据据，如患患者的症症状、血血尿各项项指标的的变化，或或物理检检查的异异常结果果，然而而表型的的改变在在许多情情况下不不是特异异的，而而且是在在疾病发发生的一一定时间间后才出出现，因因此常不不能及时时作出明明确的诊诊断。现现知各种种表型的的改变是是由基因因异常造造成的，也也就是说说基因的的改变是是引起疾疾病的根根本原因因。基因因诊断是是指采用用分子生生物学的的技术方方法来分分析受检检者的某某一特定定基因的的结构（DDNA水水平）或或功能（RRNA水水平）是是否异常常，以此此来对相相应的疾疾病进行行诊断。基因诊诊断有时时也称为为分子诊诊断或DDNA诊诊断(DDNA diaagnoosiss)。基基因诊断断是病因因的诊断断，既特特异又灵灵敏，可可以揭示示尚未出出现症状状时与疾疾病相关关的基因因状态，从从而可以以对表型型正常的的携带者者及某种种疾病的的易感者者作出诊诊断和预预测，特特别对确确定有遗遗传疾病病家族史史的个体体或产前前的胎儿儿是否携携带致病病基因的的检测具具有指导导意义。o 基因诊断断的原理理及方法法 （一）基基因诊断断的原理理疾病的发发生不仅仅与基因因结构的的变异有有关，而而且与其其表达功功能异常常有关。基因诊诊断的基基本原理理就是检检测相关关基因的的结构及及其表达达功能特特别是RRNA产产物是否否正常。由于DDNA的的突变、缺失、插入、倒位和和基因融融合等均均可造成成相关基基因结构构变异，因因此，可可以直接接检测上上述的变变化或利利用连锁锁方法进进行分析析，这就就是DNNA诊断断。对表达产产物mRRNA质质和量变变化的分分析为RRNA诊诊断(RRNA diaagnoosiss)。（二）基基因诊断断的方法法基因诊断断是以核核酸分子子杂交(nuccleiic aacidd moolecculaar hhybrridiizattionn)和聚聚合酶链链反应（PPCR）为为核心发发展起来来的多种种方法，同同时配合合DNAA序列分分析，近近年新兴兴的基因因芯片可可能会发发展成为为一种很很有用的的基因诊诊断方法法。· DNA诊诊断 常用检测测致病基基因结构构异常的的方法有有下列几几种。斑点杂杂交：根根据待测测DNAA 样本本与标记记的DNNA探针针杂交的的图谱，可可以判断断目标基基因或相相关的DDNA片片段是否否存在，根根据杂交交点的强强度可以以了解待待测基因因的数量量。等位基基因特异异的寡核核苷酸探探针（aalleele-speeciffic oliigonnuclleottidee prrobee, AASO proobe）杂杂交：是是一种检检测基因因点突变变的方法法，根据据点突变变位点上上下游核核苷酸序序列，人人工合成成约199个核苷苷酸长度度的片段段，突变变的碱基基位于当当中，经经放射性性核素或或地高辛辛标记后后可作为为探针，在在严格杂杂交条件件下，只只有该点点突变的的DNAA样本，才才出现杂杂交点，即即使只有有一个碱碱基不配配对，也也不可能能形成杂杂交点。一般尚尚合成正正常基因因同一序序列，同同一大小小的寡核核苷酸片片段作为为正常探探针。如如果受检检的DNNA样本本只能与与突变AASO探探针，不不与正常常ASOO探针杂杂交，说说明受检检二条染染色体上上的基因因都发生生这种突突变，为为突变纯纯合子；如果既既能与突突变ASSO探针针又能与与正常AASO探探针杂交交，说明明一条染染色体上上的基因因发生突突变，另另一条染染色体上上为正常常基因，为为这种突突变基因因的杂合合子；如如果只能能与正常常ASOO探针杂杂交，不不能与突突变ASSO杂交交，说明明受检者者不存在在该种突突变基因因，如图图21-1所示示。若与PCCR方法法联合应应用，即即PCRR/ASSO探针针杂交法法(PCCR/AASO proobe hybbriddizaatioon)，是是一种检检测基因因点突变变的简便便方法，先先用PCCR方法法扩增突突变点上上下游的的序列，扩扩增产物物再与AASO探探针杂交交，可明明确诊断断突变的的纯合子子和杂合合子。此此法对一一些已知知突变类类型的遗遗传病，如如地中海海贫血、苯丙酮酮尿症等等纯合子子和杂合合子的诊诊断很方方便。也也可分析析癌基因因如H-rass和抑癌癌基因如如p533的点突突变。单链构构象多态态性（ssinggle strrandd coonfoormaatioon ppolyymorrphiism, SSSCP）分分析相同同长度的的单链DDNA因因其序列列不同，甚甚至单个个碱基不不同，所所形成的的构象不不尽相同同，在非非变性聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳时时速度就就不同，若若单链DDNA用用放射性性核素标标记，显显影后即即可区分分电泳条条带。一一般先设设计引物物对突变变点所在在外显子子进行扩扩增，PPCR产产物经变变性成单单链后进进行电泳泳分析。PCRR/SSSCP方方法，能能快速、灵敏、有效地地检测DDNA突突变点，如如图211-2，此此法可用用检测点点突变的的遗传疾疾病，如如苯丙酮酮尿症、血友病病等，以以及点突突变的癌癌基因和和抑癌基基因。限制制性内切切酶图谱谱（reestrricttionn maap）分分析，如如果DNNA突变变后改变变了某一一核酸限限制性内内切酶的的识别位位点，使使原来某某一识别别位点消消失，或或形成了了新的识识别位点点，那么么相应限限制性内内切酶片片段的长长度和数数目会发发生改变变。一般般基因组组DNAA经该种种限制性性内切酶酶水解，再再做Soouthhernn印迹，根根据杂交交片段的的图谱，可可诊断该该点突变变，如图图21-3所示示。如果果用PCCR扩增增该突变变点的外外显子，PPCR产产物经该该种酶消消化后，进进行琼脂脂糖电泳泳，溴乙乙锭染色色后可直直接观察察片段的的大小及及数目。此法可可用于检检测有些些限制性性内切酶酶识别位位点消失失的遗传传疾病，如如镰状细细胞贫血血。或基基因缺失失的疾病病如地地中海贫贫血症，单单纯性生生长激素素缺乏症症等。限制性性片段长长度多态态性（rresttricctioon ffraggmennt llenggth pollymoorphhismm ,RRFLPP）遗传传连锁分分析人群群中个体体间DNNA的序序列存在在差异，据据估计每每1000-2000个核核苷酸中中便有11个发生生突变，这这种现象象称为DDNA多多态性。有些DDNA多多态性可可改变某某一限制制性内切切酶的识识别位点点，因而而产生了了DNAA限制性性片段长长度多态态性。RRFLPP按孟德德尔方式式遗传，在在某一特特定的家家庭中，如如果某一一致病基基因与特特定的多多态性片片段连锁锁，可以以遗传给给子代，因因此这一一多态性性片段可可作为遗遗传标记记，来判判断该家家庭成员员或胎儿儿的基因因组中是是否携带带该致病病基因，见见图211-4，此此法可用用于诊断断甲型血血友病、苯丙酮酮尿症、享延顿顿舞蹈病病等。 DNNA序列列分析对对致病有有关的DDNA片片段进行行序列测测定，是是诊断基基因异常常（已知知和未知知）最直直接和准准确的方方法。· RNA诊诊断 RNA诊诊断主要要是分析析基因的的表达功功能，检检测转录录物的质质和量，以以判断基基因转录录效率的的高低，以以及转录录物的大大小。RNAA印迹（NNorttherrn bblott）RNNA印迹迹是检测测基因是是否表达达，表达达产物mmRNAA的大小小的可靠靠方法，根根据杂交交条带的的强度，可可以判断断基因表表达的效效率。RT-PCRR是一种种检测基基因表达达产物mmRNAA灵敏的的方法，若若与荧光光定量PPCR结结合可对对RT-PCRR产物量量进行准准确测定定。o 基因诊断断的应用用 （一）遗遗传疾病病现知遗传传疾病有有数千种种，但多多数遗传传疾病属属少见病病例，有有些遗传传疾病在在不同民民族，不不同地区区的人群群中发病病率不同同，例如如镰状细细胞贫血血（siicklle ccelll annemiia）,非洲黑黑色人种种发病率率高，而而囊性纤纤维化症症（cyystiic ffibrrosiis）常常见于美美国白色色人种，这这二种遗遗传疾病病在我国国为罕见见病例。中国较较常见的的遗传疾疾病有地地中海贫贫血、甲甲型血友友病、乙乙型血友友病、苯苯丙酮尿尿症、杜杜氏肌营营养不良良症（DDMD）、葡萄糖糖-6磷磷酸脱氢氢酶（GG-6PPD）缺缺乏症、唐氏综综合症（DDownns synndroome）等等。根据不同同遗传疾疾病的分分子基础础，可采采用不同同的技术术方法进进行诊断断，不但但可对有有症状患患者进行行检测，而而且对遗遗传疾病病家族中中未发病病的成员员乃至胎胎儿甚至至胚胎着着床前（ppreiimpllanttatiion）进进行诊断断是否携携带有异异常基因因，这对对婚育具具有指导导意义。地中海贫贫血（地地贫）是是世界上上最常见见和发生生率最高高的一种种单基因因遗传疾疾病（mmonoogennic disseasse）,由于一一种或几几种珠蛋蛋白合成成障碍导导致类类与类类珠蛋白白不平衡衡造成的的，临床床以贫血血、黄疸疸、肝脾脾肿大及及特殊外外貌为特特征，地地贫最常常见的有有两类：地贫贫和地地贫。地贫(-tthallasssemiias)的分子子基础主主要为珠蛋白白基因缺缺失，也也有部分分病例是是由于碱碱基突变变造成的的。可采采用限制制性内切切酶图谱谱方法检检测珠珠蛋白基基因的缺缺失。人珠蛋蛋白基因因簇位于于16号号染色体体，长度度29 kb，包包含7个个连锁的的类基基因或假假基因。基因因（11及22编码序序列相同同，仅非非编码序序列稍有有差别,产物相相同），该该基因簇簇上有22个EccoRII识别位位点，经经EcooRI酶酶解，进进行Soouthhernn印迹，用用标记的的基因因片段作作探针，得得到一条条23 kb的的杂交条条带，BBamHHI识别别位点有有4个，但但只有114 kkb片段段能与mmRNAA基因探探针杂交交，见图图21-5。Hb BBartts胎胎儿水肿肿综合征征：由于于该病患患儿二条条16号号染色体体的4个个珠蛋蛋白基因因均缺失失，不能能合成链，胎胎儿全身身水肿、肝脾肿肿大、四四肢短小小，常于于妊娠330440周死死亡或早早产后半半小时内内死亡。样本DDNA经经限制性性内切酶酶图谱分分析不能能显示珠蛋白白基因区区带，RRNA诊诊断也测测定不出出有珠珠蛋白基基因的mmRNAA。缺失型HHBH病病：由于于一条116号染染色体上上的两个个珠蛋蛋白基因因均缺失失，另一一条166号染色色体上则则缺失一一个珠珠蛋白基基因，并并缺失33.7 kb长长度的DDNA片片段（右右侧缺失失型）或或4.22 kbb片段（左左侧缺失失型），DDNA诊诊断只产产生199 kbb长度的的EcooRI片片段，或或10kkb BBamHHI片段段。标准型地贫：一条116号染染色体上上2个珠蛋白白基因全全部缺失失。而另另一条116号染染色体上上具有22个正常常的珠珠蛋白基基因，DDNA诊诊断结果果，EccoRII和BaamHII都出现现与正常常一样的的23 kb或或14 kb的的条带，但但杂交条条带的放放射性自自显影较较正常人人浅。地贫(-tthallasssemiias)的基因因诊断：地贫贫的分子子基础不不同于地贫，珠蛋白白基因通通常并不不缺失，而而是由于于基因点点突变或或个别碱碱基的插插入或缺缺失。每每一民族族和人群群珠蛋蛋白基因因点突变变部位不不尽相同同，都有有特定的的类型谱谱。（二）感感染性疾疾病过去对感感染性疾疾病(iinfeectiiouss diiseaasess)的诊诊断，一一是直接接分离检检查病原原体，或或者对患患者血清清学或生生物化学学的分析析。有些些病原体体不容易易分离，有有些需经经过长期期培养才才能获得得。血清清学对病病原体抗抗体的检检测虽然然很方便便，但是是病原体体感染人人体后需需要间隔隔一段时时间后才才出现抗抗体，并并且血清清学检查查只能确确定是否否接触过过该种病病原体，但但不能确确定是否否有现行行感染，对对潜伏病病原体的的检查有有困难。对感染性性疾病的的基因诊诊断具有有快速、灵敏、特异等等优点。80年年代建立立的PCCR技术术已广泛泛应用于于对病原原体的检检测。一一般根据据各病原原体特异异和保守守的序列列设计引引物，有有的还合合成ASSO探针针，对病病原体的的DNAA可用PPCR技技术直接接检查，而而对RNNA病毒毒，则采采用RTT-PCCR。现现在市场场已经有有许多种种病原体体的测定定药盒供供应，每每一盒包包含扩增增某种病病原体的的特异引引物，所所需的酶酶以及配配妥的各各种反应应试剂，并并附有可可行的操操作方法法步骤。· 病毒性感感染： 多种病毒毒性感染染都可采采用基因因诊断检检测相应应的病原原体，如如甲型、乙型、丙型和和丁型肝肝炎病毒毒，人免免疫缺陷陷病毒、可萨奇奇病毒、脊髓灰灰质类病病毒、腺腺病毒、EB病病毒、疱疱疹病毒毒、人巨巨细胞病病毒、乳乳头状病病毒等。最最近新发发现的SSARSS冠状病病毒，在在基因组组（RNNA）序序列确定定后，便便很快建建立了RRT-PPCR的的基因诊诊断法。· 细菌性感感染： 可应用基基因诊断断检测多多种致病病性的细细菌，如如结核分分枝杆菌菌、痢疾疾性大肠肠杆菌、霍乱弧弧菌、淋淋球菌、绿脓杆杆菌等。· 寄生虫： 恶性疟原原虫、克克鲁斯锥锥虫、利利什曼原原虫、血血吸虫、弓形虫虫等等都有基基因诊断断的方法法· 其它:如如衣原体体、支原原体、真真菌性感感染也均均用基因因诊断。 （三）恶恶性肿瘤瘤分析一些些原癌基基因的点点突变、插入突突变、基基因扩增增、染色色体易位位和抑癌癌基因的的丢失或或突变，可可以了解解恶性肿肿瘤的分分子机制制，有助助于对恶恶性肿瘤瘤的诊断断，对肿肿瘤治疗疗及预后后有指导导意义。(四)法法医学中中的应用用对生物个个体识别别和亲子子鉴定传传统的方方法有血血型、血血清蛋白白型、红红细胞酶酶型和白白细胞膜膜抗原(HLAA)等，但但这些方方法都存存在着一一些不确确定的因因素。近近年来对对人基因因结构的的深入研研究发现现，有些些具有个个体特征征的遗传传标记可可用于个个体识别别和亲子子鉴定。1. DDNA指指纹分析析(DNNA ffinggerpprinntinng)近年研究究发现，人人类基因因组中许许多位点点存在着着一种可可变串联联重复序序列(vvariiablle nnumbber of tanndemm reepeaat，VVNTRR)。这这种VNNTR主主要存在在于基因因的非编编码区，重重复序列列是头对对尾串联联排列着着。人类类某些  VNTTR是由由20-50个个重复单单位组成成，每个个单位含含15-1000 bpp，DNNA的长长度为11kb至至5kbb，较普普通卫星星DNAA（约1100 kb）小小，所以以称为小小卫星DDNA（mminiisattelllitee DNNA）。经研究究发现VVNTRR有高度度的多态态性，在在人群中中的分布布表现高高度的个个体特异异性，甚甚至同一一个体同同源染色色体的等等位VNNTR的的重复单单位数也也不同，等等位基因因按孟德德尔方式式遗传。VNTTR区的的重复单单位数目目不同，所所以该区区的DNNA长度度不同。但每一一位点VVNTRR的核心心序列却却有高度度的保守守性，因因此可认认为VNNTR是是一种判判断个体体的遗传传标记。19855年， Jefffreeys根根据VNNTR的的特点，选选择某些些核心序序列作为为探针，并并选用核核心序列列无切割割位点的的限制性性内切酶酶如Hiinf11，对DDNA样样品进行行酶解，然然后作SSouttherrn印迹迹。图谱谱显示不不同个体体具有不不同条带带，如同同人的指指纹具有有高度的的个体特特异性一一样，因因此把这这种Soouthhernn印迹图图称作DDNA指指纹图谱谱(DNNA ffinggerpprinnt)，如如图211-6所所示。实实验证明明，除同同卵双生生子有相相同的图图谱外，两两个人不不可能有有完全相相同的图图谱，所所以这种种方法对对个体识识别，亲亲子鉴定定，嫌疑疑罪犯的的判断准准确可靠靠。图221-77是引自自文献报报道的结结果。可可是Soourttherrn印迹迹技术操操作繁琐琐，所需需时间长长，需要要DNAA量较大大，若DDNA降降解还会会影响对对结果的的判断 。所以，JJefffreyys又根根据每一一VNTTR区翼翼侧保守守序列设设计引物物，用PPCR方方法对该该区进行行扩增，因因VNTTR长度度不同，所所以产物物经琼脂脂糖凝胶胶电泳，染染色后，根根据条带带的不同同，可以以判断结结果。这这种方法法既方便便又省时时，对部部分酶解解DNAA也适用用，对单单根毛发发，血斑斑，皮屑屑和精迹迹都可进进行分析析。但有有些VNNTR重重复片断断较长，PPCR难难以扩增增。· 短串联重重复(sshorrt ttanddem reppeatt,STTR)多多态性分分析 90年代代初，发发现人基基因组中中存在着着数量众众多的SSTR, STTR的重重复单元元较短，核核心序列列含2-4 bbp，DDNA片片段长度度为1000-5500 bp，故故称为微微卫星DDNA (miicroosattelllitee DNNA).与VNNTR相相同, 有不少少的微卫卫星DNNA存在在着个体体间重复复单元数数目不同同的多态态性, 所以是是一种应应用价值值很高的的遗传标标记。又又因为微微卫星DDNA 较短，易易进行PPCR操操作，也也能适用用于降解解的DNNA分析析。目前前，STTR-PPCR技技术在法法医学中中的应用用已占主主导地位位。VNTRR和STTR除在在法医学学中的应应用外，还还用于遗遗传作图图, 基基因定位位及遗传传疾病的的诊断等等。· 基因治疗疗 o 基因治疗疗的慨念念 （一）基基因治疗疗的定义义从基因角角度可以以理解为为对缺陷陷的基因因进行修修复或将将正常有有功能的的基因置置换或增增补缺陷陷基因的的方法。若从治治疗角度度可以广广义地说说是一种种基于导导入遗传传物质以以改变患患者细胞胞的基因因表达从从而达到到治疗或或预防疾疾病的目目标的新新措施。导入的的基因可可以是与与缺陷基基因相对对应的有有功能的的同源基基因或与与缺陷基基因无关关的治疗疗基因。基因治疗疗有两种种形式，一一种是改改变体细细胞的基基因表达达，即体体细胞基基因治疗疗（soomattic genne ttherrapyy），另另一种是是改变生生殖细胞胞的基因因表达，即即种系基基因治疗疗（geermllinee geene theerappy），从从理论上上讲，若若对缺陷陷的生殖殖细胞进进行矫正正，不但但当代可可以得到到根治，而而且可以以将正常常的基因因传给子子代。但但生殖的的生物学学极其复复杂，且且尚未清清楚，一一旦发生生差错将将给人类类带来不不可想象象的后果果，涉及及一系列列伦理学学的问题题，目前前还不能能用于人人类。在在现有的的条件下下，基因因治疗仅仅限于体体细胞，基基因型的的改变只只限于某某一类体体细胞，其其影响只只限于某某个体的的当代。（二）基基因治疗疗的方式式基因治疗疗的方式式（tyype of genne ttherrapyy）主要要有3类类，一类类为基因因矫正或或置换，即即对缺陷陷基因的的异常序序列进行行矫正，对对缺陷基基因精确确地原位位修复，或或以正常常基因原原位置换换异常基基因，因因此不涉涉及基因因组的任任何改变变，目前前尚无体体内成功功的报道道。另一一类为基基因增补补，不去去除异常常基因，而而是通过过外源基基因的导导入，使使其表达达正常产产物，从从而补偿偿缺陷基基因的功功能。再再有一类类为基因因封闭，有有些基因因异常过过度表达达，如癌癌基因或或病毒基基因可导导致疾病病，可用用反义核核酸技术术、核酶酶或诱饵饵（deecoyy）转录录因子来来封闭或或消除这这些有害害基因的的表达。除上述述3大类类外，近近日发展展其它多多种形式式，如导导入病毒毒或细菌菌来源的的所谓“自自杀基因因”或经经过改造造的条件件性复制制病毒，只只能在pp53缺缺陷的肿肿瘤细胞胞繁殖以以达到溶溶解肿瘤瘤细胞。（三）导导入的方方式导入基因因有两种种方式，一一种是体体外导入入（exx viivo）,即在体体外将基基因导入入细胞内内，再将将这种基基因修饰饰过的细细胞回输输病人体体内，使使这种带带有外源源基因的的细胞在在体内表表达，从从而达到到治疗或或预防的的目的。被用于于修饰的的细胞可可以是自自体，同同种异体体或异种种的体细细胞。合合适的细细胞应易易于从体体内取出出和回输输，能在在体外增增殖，经经得起体体外实验验操作，能能够高效效表达外外源基因因，且能能在体内内长期存存活。目目前常用用的细胞胞有淋巴巴细胞、骨髓干干细胞、内皮细细胞、皮皮肤成纤纤维细胞胞、肝细细胞、肌肌细胞、角朊细细胞（kkeraatinnocyyte）、多种肿肿瘤细胞胞等。另另一种是是体内导导入（iin vvivoo），即即将外源源基因直直接导入入体内有有关的组组织器官官，使其其进入相相应的细细胞并进进行表达达。o 外源治疗疗基因 无论是eex vvivoo或in vivvo导入入基因的的方式，首首先要选选择合适适的能达达到治疗疗或预防防用的目目的基因因。如导导入遗传传疾病所所缺陷的的基因或或增强机机体免疫疫的细胞胞因子基基因。目目前用于于临床试试验的治治疗基因因主要为为该基因因的c DNAA。一些些临床试试验用的的基因见见表211-1作为外源源治疗基基因的条条件：基基因的大大小要根根据所用用载体（vvecttor）能能够运载载的容量量；若为为分泌性性产物需需含信号号肽序列列；cDDNA序序列应正正确无误误；翻译译时要求求有起始始密码子子及终止止密码子子。o 载体系统统 要有效将将治疗基基因导入入人体细细胞内需需要靠合合适的运运送基因因的工具具，即载载体（vvecttor），载体有两两类：一一类为病病毒载体体（viirall veectoor ）,另一类类为非病病毒载体体（noon-vviraal vvecttor）目前临床床6366个基因因治疗方方案所用用的载体体列于表表21-2目前临床床试验用用的载体体仍然以以病毒载载体居多多，占770%以以上，而而逆转录录病毒载载体约占占所用全全部载体体的1/3。非非病毒载载体以脂脂质体居居多，而而裸质粒粒DNAA的应用用有逐渐渐上升的的趋势。目前所所用的载载体尚不不尽人意意，有些些是存在在着安全全性问题题，有些些则为效效率不高高等缺点点。下面面将讨论论几类常常用载体体的构建建极其优优点。（一）逆逆转录病病毒载体体· 逆转录病病毒载体体的构建建 逆转录病病毒(rretrroviiruss)属RRNA病病毒，通通过其本本身逆转转录酶的的作用，形形成双链链DNAA原病毒毒,然后后整合于于宿主细细胞染色色体中, 详细细的基因因结构及及生活史史见第十十三章。构建载载体时以以DNAA原病毒毒为基础础，将野野生型病病毒的33类结构构基因ggag，poll和envv删除，以以供外源源基因的的插入，但但是要保保存病毒毒的包装装序列（）和双双侧的长长末端重重复（LLTR），LLTR含含有启动动子、增增强子、整合信信号及ppolyy A信信号等多多种元件件。插入入的基因因一般为为两种或或两种以以上，一一种为标标记基因因（maarkeer ggenee）供阳阳性筛选选，常用用的为原原核细胞胞的新霉霉素磷酸酸转移酶酶（NNPT ,nneoRR基因），该该酶能破破坏抗生生素G4418（新新霉素的的衍生物物）的活活性。哺哺乳动物物细胞在在含G4418的的培养液液中不能能生长，若若含有nneoRR基因能能产生NNPT ，即即能在含含有G4418的的培养液液中生长长，故便便于筛选选转导基基因的细细胞。另一种为为供治疗疗用的基基因，治治疗基因因和标记记基因可可识别受受控于不不同启动动子，其其中一种种受逆转转录病毒毒的LTTR调控控，另一一种常需需连接另另外的启启动子序序列，或或者连接接一种称称为内核核糖体进进入位点点序列（IIRESS），使使转录成成一条多多顺反子子mRNNA，在在翻译过过程中IIRESS具有内内启动作作用，能能启动蛋蛋白质的的合成，所所以同一一分子mmRNAA能合成成2种或或2种以以上不同同的蛋白白质。如何包装装成含有有外源基基因的逆逆转录病病毒供治治疗用的的呢？因因为载体体本身的的3类结结构基因因已被删删除，因因此包装装所需的的结构蛋蛋白质，需需要靠一一种所谓谓的包装装细胞，如如PA3317, 提供供，这种种细胞含含有一种种缺失包包装信号号的逆转转录病毒毒，只能能产生包包装所需需的结构构蛋白质质，但本本身的病病毒RNNA因缺缺失包装装信号,所以不不会被包包装成病病毒颗粒粒，这对对治疗的的安全性性很重要要，可避避免产生生有复制制潜能的的逆转录录病毒（RRCR）。将上述述所构建建的载体体转染包包装细胞胞PA3317，可可产生供供治疗用用的含有有治疗基基因的逆逆转录病病毒颗粒粒，见图图21-8，这这种病毒毒能高效效感染细细胞，使使治疗基基因能够够整合至至细胞的的染色体体中，从从而能长长期表达达基因产产物，以以达到治治疗目的的。· 逆转录病病毒载体体的优缺缺点 最大的优优点为能能准确整整合于宿宿主细胞胞的染色色体中，所所携带的的外源目目的基因因及有关关序列不不会发生生重排，因因而能长长期稳定定表达。感染细细胞范围围较广，感感染率比比较高，由由于结构构基因均均被删除除，因此此免疫原原性较低低。对感感染细胞胞无毒性性作用。可附加加不同的的调控元元件来提提高外源源基因的的表达效效率，并并对之进进行调控控。局限性：逆转录录病毒只只能在核核膜尚未未形成时时，才能能进入核核内，因因此它只只能将外外源基因因转移至至增殖分分裂的细细胞，而而对静止止细胞转转录效果果不佳。由于该该病毒基基因本身身不大，故故能容纳纳外源基基因的大大小有限限，应小小于8kkb。逆逆转录病病毒稳定定性较差差，难耐耐受体外外的操作作，在纯纯化或浓浓缩过程程常使其其感染性性降低。病毒颗颗粒能迅迅速被补补体破坏坏。因为为是随机机整合，所所以具有有插入突突变的危危险，特特别是病病毒制剂剂中污染染着RCCR。（二）其其他病毒毒载体· 腺病毒 感染人的的腺病毒毒(addenoovirrus)有500余种血血清型，能能感染多多种组织织器官，产产生类似似感冒或或类似流流感症状状，目前前多数采采用无致致病性的的5型及及2型腺腺病毒作作为载体体。构建建载体时时ITRR及包装装信号应应保存，其其余的部部分有些些可删除除，供外外源基因因的插入入，插入入片段的的大小可可达kkb。腺腺病毒载载体较稳稳定，能能耐受纯纯化浓缩缩等操作作，可获获得高滴滴度的病病毒颗粒粒，感染染宿主细细胞范围围较广，感感染效率率高，既既能感染染分裂相相细胞，也也能感染染非分裂裂相细胞胞，但腺腺病毒不不整合于于宿主细细胞染色色体，故故只能短短暂表达达外源基基因，最最大的缺缺点为引引起机体体的免疫疫反应和和毒副作作用。· 腺相关病病毒 属微小病病毒科，不不致病，为为单链DDNA约约4.77 kbb，腺相相关病毒毒(addenoo-asssocciatted virrus)，作为为载体最最大的优优点能感感染分裂裂相和非非分裂相相细胞，并并整合于于宿主细细胞染色色体，能能长期稳稳定表达达，无不不良反应应，适合合于一些些遗传性性疾病如如甲型和和乙型血血友病的的基因治治疗。但但腺相关关病毒载载体的制制备因需需要辅助助病毒的的参与，有有污染的的可能性性。· 其他 慢病毒（如如HIVV）、型单纯纯性疱疹疹病毒、痘病毒毒和杆状状病毒等等都被研研究发展展作为转转移基因因的载体体。（三）脂脂质体上述病毒毒载体最最大的特特点是能能高效转转移外源源目的基基因，但但是也存存在着许许多的局局限性，特特别是免免疫原性性强和可可能造成成细胞突突变危险险。因此此发展非非病毒载载体倍受受基因治治疗研究究者的注注意。借借助物理理、化学学方法或或直接将将外源基基因导入入宿主细细胞内。脂质体（llipoosomme）主主要是由由天然磷磷脂和胆胆固醇类类衍生物物组成类类似生物物膜的脂脂质双分分子层包包围水相相形成的的闭合囊囊泡。脂质体有有两类：一类为为阳离子子脂质体体，表面面带正电电荷，由由于DNNA带负负电，因因此借正正电荷的的作用，可可以浓集集和缩合合DNAA，形成成脂质体体DNAA复合物物（liipopplexx）可携携带的基基因不受受DNAA大小的的限制，见见图9。目前基基因治疗疗所用的的脂质体体都是阳阳离子脂脂质体。另一类类为带负负电脂质质体，表表面带负负电，DDNA或或其他药药物被包包埋在内内部水相相中。由于脂质质体具有有类似生生物膜的的性质，因因此当脂脂质体DDNA复复合物与与细胞膜膜接触后后，通过过胞吞作作用（eendoocyttosiis）而而进入胞胞内。脂质体载载体除上上述介导导外源基基因转移移不受大大小限制制外，最最大的优优点为无无生物源源性，无无毒性，更更安全可可靠。但但是转染染效率很很低，而而且是短短暂表达达。（四）裸裸DNAA裸DNAA（naakedd DNNA），即即将外源源基因构构建于真真核表达达质粒，借借助物理理的或机机械方法法直接将将其导入入宿主组组织细胞胞内。横横纹肌和和心肌摄摄取裸DDNA的的效率较较高。若若外源基基因表达达产物可可激发机机体免疫疫反应，以以防治某某些疾病病，可称称为DNNA疫苗苗（DNNA vvacccinee），是是一种非非常有希希望的新新型疫苗苗。直接注射射裸DNNA转染染效率不不高，常常借助一一些物理理方法。基因枪（ggenee guun），通通过高压压放电产产生强烈烈的冲击击波（sshocck wwavee），作作用于被被金包埋埋的DNNA微粒粒，使DDNA微微粒加速速运动，即即颗粒轰轰击（ppartticlle bbombbarddmennt）而而穿透组组织细胞胞，此法法不但可可用于体体外转移移基因，而而且已用用于临床床将表达达IL-12质质粒导入入浅表肿肿瘤组织织。矩形波电电穿孔仪仪（sqquarre eelecctrooporratoor）这这种仪器器能产生生低电压压的矩形形波，使使细胞穿穿孔，让让DNAA进入，因因为产生生的仅是是使细胞胞穿孔的的矩形波波，可避避免一般般电穿孔孔仪产生生的高电电压造成成细胞损损伤的缺缺点，电电压的范范围为55-5000，加加压间隔隔为1000毫秒秒-1秒秒。这种种仪器可可用于体体外基因因转移，也也可用于于体内组组织器官官的基因因转移，据据报道对对肌肉组组织的转转移效率率比直接接注射DDNA高高个数数量级以以上，是是一种很很有前景景的基因因转移方方法。o 基因治疗疗的临床床试验 目前临床床基因治治疗试验验的方案案已达99百多个个，受治治疗的患患者已有有数千例例表21-3可见见当前临临床基因因治疗（ggenee thheraapy）或或广义地地称基因因转移（ggenee trranssferr）试验验，有三三种类型型，即治治疗性、基因标标记及非非治疗性性试验。后者将将腺病毒毒载体注注射于健健康自愿愿者的体体内，观观察机体体对腺病病毒载体体的反应应。这些些方案的的临床试试验期（ttriaal pphasses）极极大多数数为期期临床试试验，期者仅仅仅个个方案。说明基基因治疗疗临床试试验尚处处于未成成熟阶段段。（一）基基因标记记目前常用用的基因因标记方方法是将将含neeoR基基因的重重组逆转转录病毒毒载体在在体外转转导细胞胞，然后后回输至至病人体体内，可可以很方方便地跟跟踪这种种标记细细胞的命命运，用用来研究究许多其其他方法法不能回回答的体体细胞移移植的生生物学问问题。美国第一一个被批批准基因因标记的的临床研研究计划划是NIIH的RRoseenbeerg等等的肿瘤瘤浸润淋淋巴细胞胞（tuumorr innfilltraatinng llympphoccytees, TILL）基因因标记实实验。他他将恶性性黑色素素瘤组织织或转移移的淋巴巴结制成成单细胞胞悬液，在在IL-2的作作用下淋淋巴细胞胞可成倍倍增殖而而肿瘤细细胞及其其他类型型细胞则则死亡。这种TTIL能能特异杀杀伤肿瘤瘤细胞。先在体体外将含含有neeoR基基因的逆逆转录病病毒载体体转导TTIL，该该载体能能整合至至TILL的基因因组，故故子代的的TILL也含有有neooR基因因，能在在含抗生生素G4418的的培养液液中生长长，便于于筛选；也可用用PCRR检测nneoRR基因是是否存在在，以跟跟踪回输输体内的的TILL的去处处。将这种基基因修饰饰过的TTIL注注射于黑黑色素瘤瘤患者，可可以研究究TILL在体内内各组织织器官、血循环环细胞、淋巴结结、肿瘤瘤组织的的分布情情况；特特别感兴兴趣的是是观察TTIL是是否能靶靶向肿瘤瘤组织；同时也也可以研研究TIIL在体体内存活活期的长长短；以以及了解解这种体体外基因因修饰过过的TIIL是否否会自主主生长和和恶变？注射后后对人体体是否有有害？这这些问题题的阐明明可为基基因治疗疗打基础础。结果果发现基基因修饰饰过的TTIL在在体外不不会自主主增殖，说说明没有有恶变。在注射射后的头头3周，用用PCRR可测出出外周血血存在着着含有nneoRR基因的的单核细细胞，有有的长至至60dd尚可测测出。在在注射后后3d活活检的肿肿瘤组织织也可测测出有基基因修饰饰过的TTIL的的存在。有人对对其他细细胞如骨骨髓细胞胞、肝细细胞和细细胞毒淋淋巴细胞胞等进行行标记研研究。（二）单单基因疾疾病遗传性单单基因疾疾病（mmonoogennic disseasses）是是基因治治疗的理理想侯选选对象，设设计治疗疗方案时时应考虑虑下列几几点因素素：对对造成该该疾病有有关的基基因应有有较详细细的了解解，并能能在实验验室克隆隆适合真真核细胞胞表达的的有关基基因的ccDNAA序列，供供转导用用。经经有功能能基因转转导的体体细胞，只只要产生生较少量量原来缺缺少的基基因产物物就能矫矫正疾病病。例如如腺苷脱脱氨酶（AADA）缺缺乏的严严重联合合免疫缺缺陷（SSCIDD），由由于淋巴巴细胞缺缺乏ADDA酶，造造成腺苷苷及dAATP的的堆积，可可破坏免免疫功能能，患儿儿