猪瘟防治技术规范31193.docx

八、猪瘟瘟防治技技术规范范猪瘟（CClasssiccal swiine fevver, CSSF）是是由黄病病毒科瘟瘟病毒属属猪瘟病病毒引起起的一种种高度接接触性、出出血性和和致死性性传染病病。世界界动物卫卫生组织织（OIIE）将将其列为为必须报报告的动动物疫病病，我国国将其列列为一类类动物疫疫病。为及时、有有效地预预防、控控制和扑扑灭猪瘟瘟，依据据中华华人民共共和国动动物防疫疫法、重重大动物物疫情应应急条例例和国国家突发发重大动动物疫情情应急预预案及及有关的的法律法法规，制制定本规规范。1 适适用范围围本规范规规定了猪猪瘟的诊诊断、疫疫情报告告、疫情情处置、疫疫情监测测、预防措措施、控控制和消消灭标准准、控制制和消灭灭标准等等。本规范适适用于中中华人民民共和国国境内一一切从事事猪（含含驯养的的野猪）的的饲养、经经营及其其产品生生产、经经营，以以及从事事动物防防疫活动动的单位位和个人人。2 诊诊断依据本病病流行病病学特点点、临床床症状、病病理变化化可作出出初步诊诊断，确确诊需做做病原分分离与鉴鉴定。2.1 流行行特点猪是本病病唯一的的自然宿宿主，发发病猪和和带毒猪猪是本病病的传染染源，不不同年龄龄、性别别、品种种的猪均均易感。一一年四季季均可发发生。感感染猪在在发病前前即能通通过分泌泌物和排排泄物排排毒，并并持续整整个病程程。与感感染猪直直接接触触是本病病传播的的主要方方式，病病毒也可可通过精精液、胚胚胎、猪猪肉和泔泔水等传传播，人人、其它它动物如如鼠类和和昆虫、器器具等均均可成为为重要传传播媒介介。感染染和带毒毒母猪在在怀孕期期可通过过胎盘将将病毒传传播给胎胎儿，导导致新生生仔猪发发病或产产生免疫疫耐受。2.2 临床床症状2.2.1 本规范范规定本本病潜伏伏期为33-100天，隐隐性感染染可长期期带毒。根据临床床症状可可将本病病分为急急性、亚亚急性、慢慢性和隐隐性感染染四种类类型。2.2.2 典型症症状2.2.2.11 发发病急、死死亡率高高；2.2.2.22 体体温通常常升至441以上、厌厌食、畏畏寒；2.2.2.33 先先便秘后后腹泻，或或便秘和和腹泻交交替出现现；2.2.2.44 腹腹部皮下下、鼻镜镜、耳尖尖、四肢肢内侧均均可出现现紫色出出血斑点点，指压压不褪色色，眼结结膜和口口腔黏膜膜可见出出血点。2.3 病理理变化2.3.1 淋巴结结水肿、出出血，呈呈现大理理石样变变；2.3.2 肾脏呈呈土黄色色，表面面可见针针尖状出出血点；2.3.3 全身浆浆膜、黏黏膜和心心脏、膀膀胱、胆胆囊、扁扁桃体均均可见出出血点和和出血斑斑，脾脏脏边缘出出现梗死死灶；2.3.4脾不不肿大，边边缘有暗暗紫色突突出表面面的出血血性梗死死；2.3.5慢性猪猪瘟在回回肠末端端、盲肠肠和结肠肠常见“钮扣状状”溃疡。2.4 实验验室诊断断实验室病病原学诊诊断必须须在相应应级别的的生物安安全实验验室进行行。2.4.1 病原分分离与鉴鉴定2.4.1.11 病病原分离离、鉴定定可用细细胞培养养法（见见附件11）；2.4.1.22 病病原鉴定定也可采采用猪瘟瘟荧光抗抗体染色色法，细细胞浆出出现特异异性的荧荧光（见见附件22）；2.4.1.33 兔兔体交互互免疫试试验（附附件3）；2.4.1.44 猪猪瘟病毒毒反转录录聚合酶酶链式反反应（RRT-PPCR）：主要用用于临床床诊断与与病原监监测（见见附件44）。2.4.1.55 猪猪瘟抗原原双抗体体夹心EELISSA检测测法：主主要用于于临床诊诊断与病病原监测测（见附附件5）。2.4.2 血清学学检测2.4.2.11 猪猪瘟病毒毒抗体阻阻断ELLISAA检测法法（见附附件6）；2.4.2.22 猪猪瘟荧光光抗体病病毒中和和试验（见见附件77）： 2.4.2.33 猪猪瘟中和和试验方方法（见见附件88）。2.5 结果果判定2.5.1 疑似猪猪瘟符合22221，22222，22223，22224，2331，2332，2333，2334之之一的。猪瘟流行病学特点、临床症状和病理变化。2.5.2 确诊非免疫猪猪符合结结果判定定2.55.1，且且符合血血清学诊诊断2.4.22.1，、2.44.2.2，、2.44.2.3，之一；，或符合合病原学学诊断22.4.1.11，、2.44.1.2，、2.44.1.3，、2.44.1.4，、2.44.1.5之一一的；免疫猪符符合结果果2.55.1，且且符合病病原学诊诊断2.4.11.1，、2.44.1.2，、2.44.1.3，、2.44.1.4，、2.44.1.5之一一的。3 疫疫情报告告3.1 任何何单位和和个人发发现患有有本病或或疑似本本病的猪猪，都应应当立即即向当地地动物防防疫监督督机构报报告。3.2 当地地动物防防疫监督督机构接接到报告告后，按按国家动动物疫情情报告管管理的有有关规定定执行。4 疫疫情处理理根据流行行病学、临临床症状状、剖检检病变，结结合血清清学检测测做出的的临床诊诊断结果果可作为为疫情处处理的依依据。4.1 当地地县级以以上动物物防疫监监督机构构接到可可疑猪瘟瘟疫情报报告后，应应及时派派员到现现场诊断断，根据据流行病病学调查查、临床床症状和和病理变变化等初初步诊断断为疑似似猪瘟时时，应立立即对病病猪及同同群猪采采取隔离离、消毒毒、限制制移动等等临时性性措施。同同时采集集病料送送省级动动物防疫疫监督机机构实验验室确诊诊，必要要时将样样品送国国家猪瘟瘟参考实实验室确确诊。4.2 确诊诊为猪瘟瘟后，当当地县级级以上人人民政府府兽医主主管部门门应当立立即划定定疫点、疫疫区、受受威胁区区，并采采取相应应措施；同时，及及时报请请同级人人民政府府对疫区区实行封封锁，逐逐级上报报至国务务院兽医医主管部部门，并并通报毗毗邻地区区。国务务院兽医医行政管管理部门门根据确确诊结果果，确认认猪瘟疫疫情。4.2.1 划定疫疫点、疫疫区和受受威胁区区疫点：为为病猪和和带毒猪猪所在的的地点。一一般指病病猪或带带毒猪所所在的猪猪场、屠屠宰厂或或经营单单位，如如为农村村散养，应应将自然然村划为为疫点。疫区：是是指疫点点边缘外外延3公公里范围围内区域域。疫区区划分时时，应注注意考虑虑当地的的饲养环环境和天天然屏障障（如河河流、山山脉等）等等因素。受威胁区区：是指指疫区外外延5公公里范围围内的区区域。4.2.2 封锁由县级以以上兽医医行政管管理部门门向本级级人民政政府提出出启动重重大动物物疫情应应急指挥挥系统、应应急预案案和对疫疫区实行行封锁的的建议，有有关人民民政府应应当立即即做出决决定。4.2.3 对疫点点、疫区区、受威威胁区采采取的措措施疫点：扑扑杀所有有的病猪猪和带毒毒猪，并并对所有有病死猪猪、被扑扑杀猪及及其产品品按照GGB1665488规定进进行无害害化处理理；对排排泄物、被被污染或或可能污污染饲料料和垫料料、污水水等均需需进行无无害化处处理；对对被污染染的物品品、交通通工具、用用具、禽禽舍、场场地进行行严格彻彻底消毒毒（见附附件9）；限制人人员出入入，严禁禁车辆进进出，严严禁猪只只及其产产品及可可能污染染的物品品运出。疫区：对对疫区进进行封锁锁，在疫疫区周围围设置警警示标志志，在出出入疫区区的交通通路口设设置动物物检疫消消毒站(临时动动物防疫疫监督检检查站)，对出出入的人人员和车车辆进行行消毒；对易感感猪只实实施紧急急强制免免疫，确确保达到到免疫保保护水平平；停止止疫区内内猪及其其产品的的交易活活动，禁禁止易感感猪只及及其产品品运出；对猪只只排泄物物、被污污染饲料料、垫料料、污水水等按国国家规定定标准进进行无害害化处理理；对被被污染的的物品、交交通工具具、用具具、禽舍舍、场地地进行严严格彻底底消毒。受威胁区区：对易易感猪只只(未免免或免疫疫未达到到免疫保保护水平平)实施施紧急强强制免疫疫，确保保达到免免疫保护护水平；对猪只只实行疫疫情监测测和免疫疫效果监监测。4.2.4 紧急监监测 对疫区、受受威胁区区内的猪猪群必须须进行临临床检查查和病原原学监测测。4.2.5 疫源分分析与追追踪调查查根据流行行病学调调查结果果，分析析疫源及及其可能能扩散、流流行的情情况。对对可能存存在的传传染源，以以及在疫疫情潜伏伏期和发发病期间间售(运)出出的猪只只及其产产品、可可疑污染染物（包包括粪便便、垫料料、饲料料等）等等应当立立即开展展追踪调调查，一一经查明明立即按按照GBB165548规规定进行行无害化化处理。4.2.6 封锁令令的解除除疫点内所所有病死死猪、被被扑杀的的猪按规规定进行行处理，疫疫区内没没有新的的病例发发生，彻彻底消毒毒10天天后，经经当地动动物防疫疫监督机机构审验验合格，当当地兽医医主管部部门提出出申请，由由原封锁锁令发布布机关解解除封锁锁。4.2.7 疫疫情处理理记录对处理疫疫情的全全过程必必须做好好详细的的记录（包包括文字字、图片片和影像像等），并并归档。5 预预防与控控制以免疫为为主，采采取“扑杀和和免疫相相结合”的综合合性防治治措施。5.1 饲养养管理与与环境控控制饲养、生生产、经经营等场场所必须须符合动动物防疫疫条件审审核管理理办法（农农业部20002115号令令）规定定的动物物防疫条条件，并并加强种种猪调运运检疫管管理。5.2 消毒毒各饲养场场、屠宰宰厂（场场）、动动物防疫疫监督检检查站等等要建立立严格的的卫生（消消毒）管管理制度度，做好好；猪圈圈、加工工厂、用用具、车车辆、粪粪便、道道路和人人员等应应进行定定期的严严格消毒毒、杀虫虫、灭鼠鼠工作（见见附件99）。5.3 免疫疫和净化化5.3.1 免免疫国家对猪猪瘟实行行全面免免疫政策策。预防免疫疫按农业业部制定定的免疫疫方案规规定的免免疫程序序进行。所用疫苗苗必须是是经国务务院兽医医主管部部门批准准使用的的猪瘟疫疫苗。5.3.2 净净化对种猪场场和规模模养殖场场的种猪猪定期采采样进行行病原学学检测，对对检测阳阳性猪及及时进行行扑杀和和无害化化处理，以以逐步净净化猪瘟瘟。5.4 监测测和预警警5.4.1 监测方方法非免疫区区域：以以流行病病学调查查、血清清学监测测为主，结结合病原原鉴定。免疫区域域：以病病原监测测为主，结结合流行行病学调调查、血血清学监监测。5.4.2 监测范范围、数数量和时时间对于各类类种猪场场每年要要逐头监监测两次次；商品品猪场每每年监测测两次，抽抽查比例例不低于于0.11%，最最低不少少于200头；散散养猪不不定期抽抽查。或或按照农农业部年年度监测测计划执执行。5.4.3 监测报报告监测结果果要及时时汇总，由由省级动动物防疫疫监督机机构定期期上报中中国动物物疫病预预防控制制中心。5.4.4 预警各级动物物防疫监监督机构构对监测测结果及及相关信信息进行行风险分分析，做做好预警警预报。5.5 消毒毒饲养场、屠屠宰厂（场场）、交交易市场场、运输输工具等等要建立立并实施施严格的的消毒制制度。5.6 检疫疫5.6.1 产地检检疫生猪在离离开饲养养地之前前，养殖殖场/户户必须向向当地动动物防疫疫监督机机构报检检。动物物防疫监监督机构构接到报报检后必必须及时时派员到到场/户户实施检检疫。检检疫合格格后，出出具合格格证明；对运载载工具进进行消毒毒，出具具消毒证证明，对对检疫不不合格的的按照有有关规定定处理。5.6.2 屠宰检检疫动物防疫疫监督机机构的检检疫人员员对生猪猪进行验验证查物物，合格格后方可可入厂/场屠宰宰。检疫疫合格并并加盖（封封）检疫疫标志后后方可出出厂/场场，不合合格的按按有关规规定处理理。5.6.3 种猪异异地调运运检疫跨省调运运种猪时时，应先先到调入入地省级级动物防防疫监督督机构办办理检疫疫审批手手续，调调出地按按照进行行检疫，检检疫合格格方可调调运。到到达后须须隔离饲饲养100天以上上，由当当地动物物防疫监监督机构构检疫合合格后方方可投入入使用。6 控控制和消消灭标准准6.1 免疫疫无猪瘟瘟区6.1.1 该区域域首先要要达到国国家无规规定疫病病区基本本条件。6.1.2 有定期期、快速速的动物物疫情报报告记录录。6.1.3 该区域域在过去去3年内内未发生生过猪瘟瘟。6.1.4 该区域域和缓冲冲带实施施强制免免疫，免免疫密度度1000%，所所用疫苗苗必须符符合国家家兽医主主管部门门规定。6.1.5 该区域域和缓冲冲带须具具有运行行有效的的监测体体系，过过去2年年内实施施疫病和和免疫效效果监测测，未检检出病原原，免疫疫效果确确实。6.1.6 所有的的报告，免免疫、监监测记录录等有关关材料详详实、准准确、齐齐全。若免疫无无猪瘟区区内发生生猪瘟时时，最后后一例病病猪扑杀杀后122个月，经经实施有有效的疫疫情监测测，确认认后方可可重新申申请免疫疫无猪瘟瘟区。6.2 非免免疫无猪猪瘟区6.2.1 该区域域首先要要达到国国家无规规定疫病病区基本本条件。6.2.2 有定期期、快速速的动物物疫情报报告记录录。6.2.3 在过去去2年内内没有发发生过猪猪瘟，并并且在过过去122个月内内，没有有进行过过免疫接接种；另另外，该该地区在在停止免免疫接种种后，没没有引进进免疫接接种过的的猪。6.2.4 在该区区具有有有效的监监测体系系和监测测区，过过去2年年内实施施疫病监监测，未未检出病病原。6.2.5 所有的的报告、监监测记录录等有关关材料详详实、准准确、齐齐全。若非免疫疫无猪瘟瘟区发生生猪瘟后后，在采采取扑杀杀措施及及血清学学监测的的情况下下，最后后一例病病猪扑杀杀后6个个月；或或在采取取扑杀措措施、血血清学监监测及紧紧急免疫疫的情况况下，最最后一例例免疫猪猪被屠宰宰后6个个月，经经实施有有效的疫疫情监测测和血清清学检测测确认后后，方可可重新申申请非免免疫无猪猪瘟区。附件1病毒分离离鉴定采用细胞胞培养法法分离病病毒是诊诊断猪瘟瘟的一种种灵敏方方法。通通常使用用对猪瘟瘟病毒敏敏感的细细胞系如如PK-15细细胞等，加加入2%扁桃体体、肾脏脏、脾脏脏或淋巴巴结等待待检组织织悬液于于培养液液中。337培养448772小时时后用荧荧光抗体体染色法法检测细细胞培养养物中的的猪瘟病病毒。步骤如下下：1. 制制备抗生生素浓缩缩液（青青霉素1100000IUU/mLL、链霉霉素1000000IU/mL、卡卡那霉素素和制霉霉菌素550000IU/mL），小小瓶分装装，-220保存。用用时融化化。2. 取取122g待检检病料组组织放入入灭菌研研钵中，剪剪刀剪碎碎，加入入少量无无菌生理理盐水，将将其研磨磨匀浆；再加入入HannkSs平衡盐盐溶液或或细胞培培养液，制制成200%(ww/v)组织悬悬液；最最后按11/100的比例例加入抗抗生素浓浓缩液，混混匀后室室温作用用1小时时；以110000g离心心15分分钟，取取上清液液备用。3. 用用胰酶消消化处于于对数生生长期的的PK-15细细胞单层层，将所所得细胞胞悬液以以10000g离离心100分钟，再再用一定定量EMMEM生生长液含5%胎牛血血清(无无BVDDV抗体体)，556灭活330分钟钟、00.3谷氨酰酰胺、青青霉素1100II U/mL、链链霉素1100II U/mL)悬浮，使使细胞浓浓度为22×106/mLL。4. 99份细胞胞悬液与与1份上上清液混混合，接接种68支含含细胞玻玻片的莱莱顿氏管管(leeighhtonns)(或其它它适宜的的细胞培培养瓶),每管管0.22mL；同时设设3支莱莱顿氏管管接种细细胞悬液液作阴性性对照；另设33支莱顿顿氏管接接种猪瘟瘟病毒作作阳性对对照。5. 经经培养224、448、772小时时，分别别取2管管组织上上清培养养物及11管阴性性对照培培养物、11管阳性性对照培培养物，取取出细胞胞玻片，以以磷酸缓缓冲盐水水（PBBS液，ppH7.2，00.011M）或或生理盐盐水洗涤涤2次，每每次5分分钟，用用冷丙酮酮(分析析纯)固固定100分钟，晾晾干，采采用猪瘟瘟病毒荧荧光抗体体染色法法进行检检测（见见附件22）。6. 根根据细胞胞玻片猪猪瘟荧光光抗体染染色强度度，判定定病毒在在细胞中中的增殖殖情况，若若荧光较较弱或为为阴性，应应按步骤骤4将组组织上清清细胞培培养物进进行病毒毒盲传。临床发病病猪或疑疑似病猪猪的全血血样是猪猪瘟早期期诊断样样品。接接种细胞胞时操作作程序如如下：取取-200冻存全全血样品品置377水浴融融化；向向24孔孔板每孔孔加3000微升升血样以以覆盖对对数生长长期的PPK-115单层层细胞；37吸附22小时。弃弃去接种种液，用用细胞培培养液洗洗涤细胞胞二次，然然后加入入EMEEM维持持液，337培养224至448小时时后，采采用猪瘟瘟病毒荧荧光抗体体染色法法检测（见见附件22）。附件2猪瘟荧光光抗体染染色法荧光抗体体染色法法快速、特特异，可可用于检检测扁桃桃体等组组织样品品以及细细胞培养养中的病病毒抗原原。操作作程序如如下：1 样样品的采采集和选选择 1.1 活体体采样：利用扁扁桃体采采样器（鼻鼻捻子、开开口器和和采样枪枪）。采采样器使使用前均均须用33%氢氧氧化钠溶溶液消毒毒后经清清水冲洗洗。首先先固定活活猪的上上唇，用用开口器器打开口口腔，用用采样枪枪采取扁扁桃体样样品，用用灭菌牙牙签挑至至灭菌离离心管并并作标记记。1.2 其它它样品：剖检时时采取的的病死猪猪脏器，如如扁桃体体、肾脏脏、脾脏脏、淋巴巴结、肝肝脏和肺肺等脏器器，或病病毒分离离时待检检的细胞胞玻片。1.3 样品品采集、包包装与运运输按农农业部相相关要求求执行。2 检检测方法法与判定定2.1 方法法：将上上述组织织制成冰冰冻切片片，或待待检的细细胞培养养片（见见附件11），将将液体吸吸干后经经冷丙酮酮固定55100分钟，晾晾干。滴滴加猪瘟瘟荧光抗抗体覆盖盖于切片片或细胞胞片表面面，置湿湿盒中337作用330分钟钟。然后后用PBBS液洗洗涤，自自然干燥燥。用碳碳酸缓冲冲甘油（ppH9.099.5，0.5 M）封片，置荧光显微镜下观察。必要时设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。2.2 判定定：在荧荧光显微微镜下，见见切片或或细胞培培养物（细细胞盖片片）中有有胞浆荧荧光，并并由抑制制试验证证明为特特异的荧荧光，判判猪瘟阳阳性；无无荧光判判为阴性性。2.3 荧光光抑制试试验：将将两组猪猪瘟病毒毒感染猪猪的扁桃桃体冰冻冻切片，分分别滴加加猪瘟高高免血清清和健康康猪血清清（猪瘟瘟中和抗抗体阴性性），在在湿盒中中37作用330分钟钟，用生生理盐水水或PBBS(ppH7.2)漂漂洗2次次，然后后进行荧荧光抗体体染色。经经用猪瘟瘟高免血血清处理理的扁桃桃体切片片，隐窝窝上皮细细胞不应应出现荧荧光，或或荧光显显著减弱弱；而用用阴性血血清处理理的切片片，隐窝窝上皮细细胞仍出出现明亮亮的黄绿绿色荧光光。附件件3兔体交互互免疫试试验本方法用用于检测测疑似猪猪瘟病料料中的猪猪瘟病毒毒。1 试试验动物物家兔 1.552kkg、体体温波动动不大的的大耳白白兔，并并在试验验前1天天测基础础体温。2 试试验操作作方法将病猪的的淋巴结结和脾脏脏，磨碎碎后用生生理盐水水作1：10稀稀释，对对3只健健康家兔兔作肌肉肉注射，55mL/只，另另设3只只不注射射病料的的对照兔兔，间隔隔5天对对所有家家兔静脉脉注射11:200的猪瘟瘟兔化病病毒（淋淋巴脾脏脏毒），11mL/只，224h后后，每隔隔6小时时测体温温一次，连连续测996小时时，对照照组2/3出现现定型热热或轻型型热，试试验成立立。3 兔兔体交互互免疫试试验结果果判定接种病料料后体温温反应接种猪瘟瘟兔化弱弱毒后体体温反应应结果判定定-含猪瘟病病毒-+不含猪瘟瘟病毒+-含猪瘟兔兔化病毒毒+含非猪瘟瘟病毒热热原性物物质注：“+”表示多多于或等等于三分分之二的的动物有有反应。附件4猪瘟病毒毒反转录录聚合酶酶链式反反应（RRT-PPCR）RT-PPCR方方法通过过检测病病毒核酸酸而确定定病毒存存在，是是一种特特异、敏敏感、快快速的方方法。在在RT-PCRR扩增的的特定基基因片段段的基础础上，进进行基因因序列测测定，将将获得的的基因信信息与我我国猪瘟瘟分子流流行病学学数据库库进行比比较分析析，可进进一步鉴鉴定流行行毒株的的基因型型，从而而追踪流流行毒株株的传播播来源或或预测预预报新的的流行毒毒株。1 材料与与样品准准备1.1 材料料准备：本试验验所用试试剂需用用无RNNA酶污污染的容容器分装装；各种种离心管管和带滤滤芯吸头头需无RRNA酶酶污染；剪刀、镊镊子和研研钵器须须经干烤烤灭菌。1.2 样品品制备：按1：5（WW/V）比比例，取取待检组组织和PPBS液液于研钵钵中充分分研磨，4，1000g离心15分钟，取上清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次备用；其它样品酌情处理。制备的样品在28保存不应超过24小时，长期保存应小分装后置-70以下，避免反复冻融。2 RNAA提取2.1 取11.5mmL离心心管，每每管加入入8000L RRNA提提取液（通通用Trrizool）和和被检样样品2000L，充充分混匀匀，静置置5分钟钟。同时时设阳性性和阴性性对照管管，每份份样品换换一个吸吸头。2.2 加入入2000L氯仿仿，充分分混匀，静静置5分分钟，44、120000gg离心115分钟钟。2.3 取上上清约5500L（注注意不要要吸出中中间层）移移至新离离心管中中，加等等量异丙丙醇，颠颠倒混匀匀，室温温静置110分钟钟，4、120000gg离心110分钟钟。2.4 小心心弃上清清，倒置置于吸水水纸上，沾沾干液体体；加入入10000L 775%乙乙醇，颠颠倒洗涤涤，4、120000gg离心110分钟钟。2.5 小心心弃上清清，倒置置于吸水水纸上，沾沾干液体体；40000 g离心心10分分钟，将将管壁上上残余液液体甩到到管底部部，小心心吸干上上清，吸吸头不要要碰到有有沉淀的的一面，每每份样品品换一个个吸头，室室温干燥燥。2.6 加入入10L DDEPCC水和110U RNaasinn,轻轻轻混匀，溶溶解管壁壁上的RRNA，4000 g离心10分钟，尽快进行试验。长期保存应置-70以下。3 cDNAA合成取2000L PPCR专专用管，连连同阳性性对照管管和阴性性对照管管，每管管加100L RRNA和和50 pM下下游引物物P2 (P25-CACCAG（CCT）CCC（AAG）AAA（TTC）CCC（AAG）AAAGTTCATTC-33)，按按反转录录试剂盒盒说明书书进行。4 PCR4.1 取2200LPCCR专用用管，连连同阳性性对照管管和阴性性对照管管，每管管加上述述10L ccDNAA和适量量水，995预变性性5分钟钟。4.2 每管管加入110倍稀稀释缓冲冲液5L，上上游引物物P1（5-TC（GA）（AT）CAACCAA（TC）GAGATAGGG-3）和下游引物P2各50pM，10 mol/L dNTP 2L，Taq酶2.5U，补水至50L。4.3 置PPCR仪仪，循环环条件为为95°C 50ssec，58°C 60ssec，72°C 35ssec，共共40个循循环，772°C延伸5分钟。5 结果判定定 取RT-PCRR产物5L，于于1%琼脂脂糖凝胶胶中电泳泳，凝胶胶中含00.5L /mmL溴化化乙锭，电电泳缓冲冲液为00.5××TBEE，80VV 300分钟，电电泳完后后于长波波紫外灯灯下观察察拍照。阳阳性对照照管和样样品检测测管出现现2511nt的的特异条条带判为为阳性；阴性管管和样品品检测管管未出现现特异条条带判为为阴性。附件5猪瘟抗原原双抗体体夹心EELISSA检测测方法本方法通通过形成成的多克克隆抗体体-样品品-单克克隆抗体体夹心，并并采用辣辣根过氧氧化物酶酶标记物物检测，对对外周血血白细胞胞、全血血、细胞胞培养物物以及组组织样本本中的猪猪瘟病毒毒抗原进进行检测测的一种种双抗体体夹心EELISSA方法法。具体体如下：1 试试剂盒组组成1.1 多克克隆羊抗抗血清包包被板条条 8孔孔×12条条（966孔）1.2 CSSFV阳阳性对照照，含有有防腐剂剂 11.5mmL1.3 CSSFV阴阴性对照照，含有有防腐剂剂 11.5mmL1.4 1000倍浓浓缩辣根根过氧化化物酶标标记物（1100××） 辣辣根过氧氧化物酶酶标记抗抗鼠IggG，含含防腐剂剂 2000uL1.5 100倍浓缩缩样品稀稀释液（110×） 555mLL1.6 底物物液，TTMB/H2O2溶液 122mL1.7 终止止液，11M HHCL（小小心，强强酸） 12mmL1.8 100倍浓缩缩洗涤液液（100×） 1125mmL1.9 CSSFV单单克隆抗抗体，含含防腐剂剂 4mmL1.100 酶酶标抗体体稀释液液 155 mLL2 样样品制备备注意：制制备好的的样品或或组织可可以在227保存77天，或或-200冷冻保保存6个个月以上上。但这这些样品品在应用用前应该该再次以以15000g离离心100分钟或或100000gg离心225分分钟。2.1 外周周血白细细胞2.1.1 取100mL肝肝素或EEDTAA抗凝血血样品，1500g离心1520分钟。2.1.2 再用移移液器小小心吸出出血沉棕棕黄层，加加入5000uLL样品稀稀释液（11×）,在旋旋涡振荡荡器上混混匀，室室温下放放置1小小时，期期间不时时旋涡混混合。然然后直接接进行步步骤2.1.66操作。2.1.3 假如样样品的棕棕黄层压压积细胞胞体积非非常少，那那么就用用整个细细胞团（包包括红细细胞）。将将细胞加加进100mL的的离心管管，并加加入5mmL预冷冷（27，下同同）的00.177M NNH4Cl。混混匀，静静置100分钟。2.1.4 用冷（227）超纯纯水或双双蒸水加加满离心心管，轻轻轻上下下颠倒混混匀，115000g离心心5分钟钟。2.1.5 弃去上上清，向向细胞团团中加入入5000uL样样品稀释释液（11×）,用用洁净的的吸头悬悬起细胞胞，在旋旋涡振荡荡器上混混匀，室室温放置置1小时时。期间间不时旋旋涡混合合。2.1.6 15000g离离心5分分钟,取取上清液液按操作作步骤进进行检测测。注意：处处理好的的的样品品可以在在277保存77天，或或-200冷冻保保存6个个月以上上。但这这些样品品在使用用前必须须再次离离心。2.2 外周周血白细细胞（简简化方法法）2.2.1 取0.522mL肝肝素或EEDTAA抗凝血血与等体体积冷00.177 M NH44Cl加加入离心心管混合合。室温温放置110分钟钟。2.2.2 15000g离离心100分钟（或或100000gg离心223分分钟），弃弃上清。2.2.3 用冷（227）超纯纯水或双双蒸水加加满离心心管，轻轻轻上下下颠倒混混匀，115000g离心心5分钟钟。2.2.4 弃去上上清，向向细胞团团加入5500uul样本本稀释液液（1××）。旋旋涡振荡荡充分混混匀，室室温放置置1小时时。期间间不时旋旋涡混匀匀。取775ull按照“操作步步骤”进行检检测。2.3 全血血（肝素素或EDDTA抗抗凝）2.3.1 取取25uuL 110倍浓浓缩样品品稀释液液（100×）和4475uuL全血血加入微微量离心心管，在在旋涡振振荡器上上混匀。2.3.2 室温下下孵育11小时，期期间不时时旋涡混混合。此此样品可可以直接接按照“操作步步骤”进行检检测。或：直接接将755uL全全血加入入酶标板板孔中，再再加入110uLL 5倍倍浓缩样样品稀释释液（55×）。晃晃动酶标标板板板条，使使样品混混合均匀匀。再按按照“操作步步骤”进行检检测。2.4 细胞胞培养物物2.4.1 移去细细胞培养养液，收收集培养养瓶中的的细胞加加入离心心管中。2.4.2 25000g离离心5分分钟，弃弃上清。2.4.3 向细胞胞团中加加入5000uLL样品稀稀释液（11×）。旋旋涡振荡荡充分混混匀，室室温孵育育1小时时。期间间不时旋旋涡混合合。取此此样品775uLL按照“操作步步骤”进行检检测。2.5 组织织最好用新新鲜的组组织。如如果有必必要，组组织可以以在处理理前于227冷藏保保存1个个月。每每只动物物检测112种种组织，最最好选取取扁桃体体、脾、肠肠、肠系系膜淋巴巴结或肺肺。2.5.1 取12g组织织用剪刀刀剪成小小碎块（225mmm大小小）。2.5.2 将组织织碎块加加入100mL离离心管，加加入5mmL样品品稀释液液（1××）,旋旋涡振荡荡混匀，室室温下孵孵育121小小时，期期间不时时旋涡混混合。2.5.3 2.5.3 115000g离心心5分钟钟，取775uLL上清液液按照“操作步步骤”进行检检测。3 操操作步骤骤注意：所所有试剂剂在使用用前应该该恢复至至室温118222；使用用前试剂剂应在室室温条件件下至少少放置11小时。3.1 每孔孔加入225uLLCSFFV特异异性单克克隆抗体体。此步步骤可以以用多道道加样器器操作。3.2 在相相应孔中中分别加加入755uL阳阳性对照照、阴性性对照，各各加2孔孔。注意意更换吸吸头。3.3 在其其余孔中中分别加加入755uL制制备好的的样品，注注意更换换吸头。轻轻轻拍打打酶标板板，使样样品混合合均匀。3.4 置湿湿盒中或或用胶条条密封后后室温（118222）孵育过过夜。也也可以孵孵育4个个小时，但但是这样样会降低低检测灵灵敏度。3.5 甩掉掉孔中液液体，用用洗涤液液（1××）洗涤涤5次，每每次洗涤涤都要将将孔中的的所有液液体倒空空，用力力拍打酶酶标板，以以使所有有液体拍拍出。或或者，每每孔加入入洗涤液液25003000uLL用自动动洗板机机洗涤55次。注注意:，洗涤酶酶标板要要仔细。3.6 每孔孔加入1100uuL稀释释好的辣辣根过氧氧化物酶酶标记物物，在湿湿盒或密密封后置置室温孵孵育1小小时。3.7 重复复操作步步骤3.5；每每孔加入入1000uL底底物液，在在暗处室室温孵育育10分分钟。第第1孔加加入底物物液开始始计时。3.8 每孔孔加入1100uuL终止止液终止止反应。加加入终止止液的顺顺序与上上述加入入底物液液的顺序序一致。3.9 在酶酶标仪上上测量样样品与对对照孔在在4500nm处处的吸光光值，或或测量在在4500nm和和6200nm双双波长的的吸光值值（空气气调零）。3.100 计计算每个个样品和和阳性对对照孔的的矫正OOD值的的平均值值（参见见“计算方方法”）。4 计计算方法法首先计算算样品和和对照孔孔的ODD平均值值，在判判定结果果之前，所所有样品品和阳性性对照孔孔的ODD平均值值必须进进行矫正正，矫正正的ODD值等于于样本或或阳性对对照值减减去阴性性对照值值。矫正ODD值样样本ODD值阴阴性对照照OD值值5 试试验有效效性判定定阳性对照照OD平平均值应应该大于于0.5500，阴阴性对照照OD平平均值应应小于阳阳性对照照平均值值的200，试试验结果果方能有有效。否否则，应应仔细检检查实验验操作并并进行重重测。如如果阴性性对照的的OD值值始终很很高，将将阴性对对照在微微量离心心机中1100000g离离心35分钟钟，重新新检测。6 结结果判定定被检样品品的矫正正OD值值大于或或等于00.3000，则则为阳性性；被检样品品的矫正正OD值值小于00.2000，则则为阴性性；被检样品品的矫正正OD值值大于00.2000，小小于0.3000，则为为可疑。附件6猪瘟病毒毒抗体阻阻断ELLISAA检测方方法本方法是是用于检检测猪血血清或血血浆中猪猪瘟病毒毒抗体的的一种阻阻断ELLISAA方法，通通过待测测抗体和和单克隆隆抗体与与猪瘟病病毒抗原原的竞争争结合，采采用辣根根过氧化化物酶与与底物的的显色程程度来进进行判定定。1 操操作步骤骤在使用时时，所有有的试剂剂盒组分分都必须须恢复到到室温118225。使用用前应将将各组分分放置于于室温至至少1小小时。1.1 分别别将500uL样样品稀释释液加入入每个检检测孔和和对照孔孔中。1.2 分别别将500uL的的阳性对对照和阴阴性对照照加入相相应的对对照孔中中，注意意不同对对照的吸吸头要更更换，以以防污染染。1.3 分别别将500uL的的被检样样品加入入剩下的的检测孔孔中，注注意不同同检样的的吸头要要分开，以以防污染染。1.4 轻弹弹微量反反应板或或用振荡荡器振荡荡，使将反应板板中的溶溶液混匀匀。1.5 将微微量反应应板用封封条封闭闭置或于湿箱箱中（118225）孵育育2小时时，也可可以将微微量反应应板用封封条置或于湿箱箱中孵育育过夜。1.6 吸出出反应孔孔中的液液体，并并用稀释释好的洗洗涤液洗洗涤3次次，注意意每次洗洗涤时都都要将洗洗涤液加加满反应应孔。1.7 分别别将1000uLL的抗CCSFVV酶标二二抗（即即取即用用）加入入反应孔孔中，用用封条封封闭反应应板并于于室温下下或湿箱箱中孵育育30分分钟。1.8 洗板板（见11.6）后后，分别别将1000uLL的底