组织细胞学观察研究方法课件81577.docx

生物显微技技术讲义义唐山师范学学院生命命科学系系陈超 石洪凌凌2005.3前言生物显微技技术是高高等院校校生物系系各专业业的基础础课,包包含生物物材料固固定技术术、生物物染色技技术、各各种显微微切片制制作技术术、显微微化学技技术显微微摄影技技术。通通过这门门课的学习习，希望望能够帮帮助大家家加强生生物实验验的技能能。使学学生掌握握制作动动、植物物显微切切片的技技术,掌掌握使用用光学显显微镜及及进行显显微摄影影所必备备的基本本理论、基基本知识识和基本本技术。本生物显显微技术术大实验验是为为了配合合这门课课的教学学，在参参考了国国内一些些相关教教材的基基础上，结结合本教教研室的的历年实实验经验验与心得得而编写写的，仅仅供唐山山师范学学院生命命科学系系学生使使用。生生物显微微技术的的内容在在其他教教材中叙叙述比较较零乱，没没有统一一的整体体性。本本指导在在结合我我系教学学安排和和实验的的前提下下，有针针对性的的安排了了生物显显微技术术的理论论教授和和实验指指导。内内容主要要包括石石蜡切片片的制作作、显微微摄影知知识、数数码显微微镜及软软件的使使用。由于编者业业务水平平和工作作经验所所限，虽虽然做了了大量努努力，书书中难免免还会存存在缺点点和不足足。为此此切盼广广大师生生在使用用本书过过程中能能提出批批评和建建议，以以备在以以后的日日子里改改进和提提高。 编者2005年年1月于于唐山师师范学院院目录第一章生物物制片.4第一节前期期准备.4第二节生物物制片分分类.8第三节石蜡蜡切片.10第二章显微微摄影技技术.37第三章暗室室技术48第一节感光光材料.448附 彩色色显微摄摄影和黑黑白显微微摄影的的相关知知识53第二节暗房房工艺57第四章数码码显微摄摄影64实验一 徒手切切片与整整体制片片法. .666实验二 11、石蜡蜡切片技技术固定、染染色、返返蓝7002、石蜡切切片技术术脱水、透透明、浸浸蜡、包包埋.72 3、石蜡切片技术切片、粘片、脱蜡、透明、封藏 74实验三 显微摄摄影及暗室技技术778实验四数码码显微摄摄影及研研究分析析软件的的使用88实验五 所作切切片的观观察照相相、提交交作业99第一章 生生物制片片第一节 前前期准备备一、玻璃器器皿的清清洗：（一）生物物学实验验使用的的玻璃器器皿及玻玻片均要要清洗干干净, 应以壁壁面被水水均匀润润湿而无无水珠为为标准。表1-1一一般器皿皿的洗涤涤方法玻璃器皿可选用洗涤涤液及洗洗涤方法法新购置未用用过的器器皿一般使用过过的器皿皿沾有不溶物物或刷洗洗不易达达到的器器皿沾有较多凡凡士林或或其他油油污的器器皿沾有油脂物物质的器器皿洗衣粉、洗洗涤剂煮煮洗，或或重铬酸酸钾洗液液浸洗330分钟钟洗衣粉、洗洗涤剂刷刷洗重铬酸钾洗洗液浸泡泡先用二甲苯苯或汽油油擦洗，再再用浓碱碱或热洗洗涤剂刷刷洗热洗涤剂，或或3040%的碱液液 玻璃器皿经经洗涤液液清洗后后自来水水冲洗蒸馏水水冲洗倒放于于大张滤滤纸上晾晾干或玻玻璃仪器器烘干器器烘干。（二）洗液液配法：重铬酸酸钾 220g浓硫酸 1000ml清水 1000mll先将重铬酸酸钾溶于于水中，在在一滴滴滴加入浓浓硫酸，边边加边搅搅拌，颜颜色为红红褐色放放于玻璃璃容器内内可反复复使用，一一直到颜颜色变为为蓝黑色色为止。（三）新旧旧载玻片片及盖玻玻片的清清洗：1新的：2%盐盐酸酒精精（955%酒精精1000份加浓浓盐酸22份）浸浸泡几个个小时流水冲冲洗干净净95%酒精中中待用。2.旧的：没用树树胶封片片的：洗洗衣粉煮煮沸5-10分分钟清水冲冲洗洗液330分钟钟流水冲冲洗蒸馏水水洗净95%酒精中中待用。3.树胶封封片的玻玻片：二二甲苯浸浸泡、洗洗净95%酒精中中待用。二、溶液的的配制：（一）百分分比浓度度 :质质量百分分比浓度度。即1100gg溶液中中所含溶溶质的克克数。1.稀溶液液的配置置：例1：1%的番红红水溶液液即将番番红1克克溶解于于1000 mll的蒸馏馏水中。例2：0.1%固固绿酒精精溶液即将固固绿0.1克溶溶解于1100mml的995%酒酒精中。2.浓溶液液的配置置：配置置高浓度度的溶液液，应在在1000ml的的水中减减去溶质质重量的的水。例：15%NaCCL称取取15gNNaCLL,溶于于85mll水中。（二）摩尔尔浓度：1升溶液液中所含含溶质的的moll数。用用M表示示。例：配制5500mml 22M NNaCOO3溶液 称取2×1106××0.55=1006g NaCCO3溶于5500mml水中中。（三）当量量浓度：1升溶液液中所含含溶质的的克当量量数。用用N表示示。当量（E）与与分子量量（MWW）的关关系：EE=MWW/n其中酸的nn为酸分分子中可可被金属属取代的的氢原子子数碱的n为碱碱分子中中金属的的原子价价盐类的n为为盐分子子中金属属的原子子数乘金金属的原原子价如：HNOO3的当量量=633/1=63H2SO44的当量量=988/2=49Ca(OHH)2的当量量=744/2=37Al2(SSO4)3的当量量=3442/22*3=57一般溶液的的配制用用烧杯、量量筒；准准确溶液液的配制制用容量量瓶。(四)酒精精稀释法法（交叉叉稀释法法）：95%酒精精83%酒精先在量筒中中加入883mll95%酒精,再加水水至955ml即即得。95%酒精精70%酒精先在量筒中中加入770mll95%酒精,再加水水至955ml即即得。95%酒精精50%酒精先在量筒中中加入550mll95%酒精,再加水水至955ml即即得。95%酒精精35%酒精先在量筒中中加入335mll95%酒精,再加水水至955ml即即得。（五）常用用液态酸酸的配置置：表1-2常常用液态态酸的配配制酸名分子量比重酸浓度（%）摩尔浓度(moll/L)配制1M所所需溶质质的量（mml） 盐酸硝酸硫酸磷酸高氯酸冰醋酸36.46663.02298.08898.0100.55060.0331.191.421.841.691.671.0636.069.596.085.070.099.511.715.617.95514.711.65517.685.564.155.768.085.856.8三、制定实实验计划划：制定计划时时首先要要考虑到到制片的的目的，其其次是选选择制片片的标本本，最后后才是确确定具体体的制作作方法。例例如制玉玉米茎的的横切面面，其目目的在于于观察维维管束的的结构，那么就应选择老的茎作标本。又如作某一种叶子的生态解剖，所选择的标本就不应该再同一地点，应在不同环境条件下多采集几份，才好做比较。由此可见制片的目的与标本选择有密切联系，有时甚至二者是需要同时决定的。最后可根据据目的要要求及所所选择的的标本确确定具体体制片的的方法。一一般讲，制制片技术术的方法法虽然很很多，但但对某一一材料来来说可能能多不是是十全十十美的。因因此我们们在制定定计划时时，不妨妨多采用用几种方方法，以以便比较较。同时时也要注注意经济济原则。方方法确定定后，在在计划中中还需将将所用的的药品、用用具等名名称及数数量逐一一列出，然然后在定定出具体体的工作作日程。制订试验计计划需要要比较丰丰富的知知识和经经验，所所以在订订计划之之前，必必须要阅阅读参考考文献，深深入钻研研。初学学者可在在有经验验的老师师指导下下制订出出比较完完善和精精密的实实验计划划。 （四）日程程与记录录：制片是一个个连续的的过程，从从标本的的采集、固固定、切切片、染染色到封封藏为止止，往往往要连续续几天，如如果事前前没有工工作日程程、就会会造成混混乱。除除编排日日程表外外，还必必须将工工作过程程中的实实际情况况连同日日程表都都详细的的记载在在记录本本上。这这样可根根据结果果检查实实际工作作中的问问题所在在，总结结失败原原因，也也可以总总结成功功的经验验。所以以日程表表和详实实地记录录对制片片工作来来说，是是一件非非常重要要而且必必须长期期坚持的的工作。这这些记录录不仅要要详实，而而且还要要作为档档案保存存起来。表1-3制制片记录录表材料固定液、固固定时间间冲洗脱水酒精时间透明1/2纯酒酒精+11/2二二甲苯时间浸蜡包埋切片厚度染色封藏结果备注第二节 生生物制片片分类一、 生物制片的的分类:（一） 切片法:1.徒手切切片:尽尽量切薄薄,切一一层细胞胞,此法法多用于于植物切切片的临临时观察察。2.石蜡切切片：44-122m厚，用用石蜡浸浸透到组组织中，并并包埋组组织，用用旋转切切片机把把蜡块切切成薄片片。3.半薄切切片：00.5-1m厚，用用树脂包包埋。用用途:在在光镜下下观察尽尽量薄；为超薄薄切片定定位，因因为其制制片技术术和超薄薄切片一一致。4.冰冻切切片：使使组织内内部及周周围的水水份结冰冰，组织织变硬，然然后用切切片机切切成薄片片，制成成切片，此此法制作作步骤少少，用时时短，不不经脱水水和透明明，故对对脂类无无影响。常常用于临临床快速速病理分分析。5.木材切切片：110-220m厚，很很硬，需需软化，用用50%酒精：甘油=1：11软化几几天，滑滑行切片片机切。6.火棉胶胶切片：用火棉棉胶包埋埋组织，滑滑行切片片机切成成薄片，主主要用于于大块组组织切片片。（二）非切切片法:1.整体装装片法：对于小小的动植植物体或或较大动动植物体体的一部部分，不不经切片片而直接接制成玻玻片的方方法。如如昆虫口口器、水水螅、藻藻类、植植物叶、茎茎表皮细细胞。2.涂片法法：对于于流动和和半流动动的材料料，不能能切片，而而直接将将材料涂涂成玻片片标本，干干燥后进进行固定定、染色色及封固固。如血血液、细细菌、骨骨髓。如如图1-1。3.压片法法：将一一些柔软软的材料料置于载载玻片上上，盖上上盖玻片片，用一一定的压压力将标标本压碎碎或压开开，制成成玻片的的方法。如如洋葱根根尖染色色体观察察，果蝇蝇唾腺染染色体观观察。4.伸展法法：一些些成膜状状结构的的标本，使使它展平平放在载载玻片上上，撕开开、展平平制成铺铺片标本本，待干干燥后经经固定、染染色后制制成玻片片标本的的方法。常常用于疏疏松结缔缔组织、神神经等柔柔软组织织或肠系系膜等薄薄层组织织。如图图1-22。5.磨片法法：主要要用于含含有钙盐盐等矿物物质，成成份坚硬硬的材料料，如脊脊椎动物物的牙齿齿、骨等等用磨石石磨成薄薄片，再再封固成成玻片。如如图1-3。6.分离法法：为了了观察研研究组织织或器官官里的单单个细胞胞或纤维维的形状状，必须须设法使使细胞与与细胞间间质分离离，细胞胞便各自自分离开开来，再再经染色制制成玻片片标本的的方法叫叫分离法法。一般般分为化化学分离离法和撕撕碎法两两种。如如神经细细胞分离离装片，平平滑肌细细胞分离离装片。图1-1涂涂片法 图11-2展展片法 图1-3磨片片法第三节 石石蜡切片片石蜡切片过过程：取材固定定冲洗脱水透明浸蜡包埋切片贴片脱蜡染色脱水透明封藏一、取材：（一）生物物组织取取材的注注意事项项：1.取材应应遵循准准确、典典型、完完整、适适时的原原则。2.研究正正常结构构应选取取健全而而又有代代表性的的部分取取材，采采取病理理材料时时，除取取病理部部位外，还还应选取取正常部部位，以以利于对照观观察。3.取材前前，要根根据要求求选择并并配制好好固定液液，取材材后，立立即投入入固定液液中，以以防组织织自溶和和腐败。4.切取材材料时，刀刀必须锐锐利，动动作要快快且仔细细，切割割时切勿勿拉锯式式的来回回切取，镊镊取也应应轻拿轻轻放，避避免材料料的损坏坏。5.取材要要详细记记录日期期、采集集地点、标标本名称称、取材材部位、断断面和所所用固定定液等。（二）植物物材料的的取材：1.固定前前对材料料要进行行切割：原因：（1）为了了固定更更容易为保证下一一步固定定材料能能迅速的的杀生和和固定，务务必使各各细胞立立刻停止止生命活活动，而而不使原原生质有有崩解的的现象。普普通应用用的固定定液对于于植物体体外表面面的角质质、木栓栓质等的的穿透很很慢，但但对于被被切割的的表面，则则穿透速速度快很很多。所所以，我我们在固固定材料料的时候候，应将将所需要要的部分分分割到到最小块块、段或或片、以以达到立立刻杀生生与固定定的目的的。（2）石蜡蜡块也有有一定限限制，一一般（55-6mmm）。2.切割面面一般分分为两类类：（1）横切切面：使使用刀横横越根、茎茎的横断断面的切切面，横横切片可可观察材材料自外外向内的的各种组组织。（2）纵切切面：刀刀的切向向与根、茎茎的长轴轴方向平平行的切切面，这这种切面面又分为为两种：半径切面面：以刀刀穿过中中心点与与其半径径吻合的的切面，这这种切面面可观察察到茎中中各种组组织纵走走的情形形及髓的的排列、厚厚度等。切线切面面：以刀刀沿植物物体的表表面与其其半径成成直角所所切的切切面。3.不同材材料的切切割方法法（1）叶片片：叶片片宽小于于1cmm,可沿主主脉横切切3-55mm叶片宽大于于1cmm,可分分割成许许多片，选选其中含含主脉和和侧脉的的固定，一一般5-7mmm2方块。（2）圆柱柱形材料料：直径径小于22mm，有有角质层层的，切切2mmm厚。无无角质层层的，固固定液穿穿透容易易，切55-100mm厚厚。直径径大于等等于5mmm，切切5mmm厚。直直径大于于10mmm,切切2-55mm厚。直直径很大大，取楔楔形（3）木质质小枝：直径小小于5mm，切成成15mmm长木条和大枝枝：直径径较大的的,切成成2-33cm厚，再再分割成成楔形小小块。（三）动物物取材：活体直接取取材、麻麻醉后取取材、处处死后取取材。无无论采取取那种处处死方法法，多应应避免由由于痛苦苦引起挣挣扎，而而造成组组织结构构发生变变化，同同时取样样必须迅迅速，越越快越好好。因为为动物一一旦死亡亡，细胞胞便开始始自溶。二、固定（ffixaatioon）:细胞生生命现象象的突然然终结，并并保持生生活状态态的形态态和结构构。（一）固定定的目的的和作用用：1.可以防防止细胞胞自溶和和腐败，在在整个制制片过程程中保存存细胞内内的各种种内含物物。2.增强细细胞对各各种浓度度渗透压压的抵抗抗能力。3.可使细细胞成份份沉淀和和凝固，因因而产生生不同的的折射率率，造成成光学上上的差异异，使得得原来看看不清楚楚的一些些结构清清晰起来来。4.有些固固定剂可可使细胞胞各部分分容易染染色。（二）作为为固定液液的条件件：1.对组织织细胞渗渗透能力力强，立立即将细细胞杀死死。2.细胞内内含物不不能发生生变化。（不不能是细细胞内某某些成份份的溶剂剂。）（酒酒精是脂脂类物质质的溶剂剂，所以以单独使使用时收收到一定定的限制制。酒精精不适宜宜作膜结结构观察察的固定定剂）3.尽可能能避免组组织或细细胞膨胀胀或收缩缩。4.有利于于增加细细胞内含含物的折折光程度度，增加加媒染作作用或染染色能力力。5.使材料料适当变变硬，并并具有一一定的坚坚硬性便便于切片片。（三）按固固定的方方式将固固定液分分为两类类：凝结型固定定液：使使蛋白质质凝固，形形成悬浮浮颗粒网网状混合合液。非凝结型固固定液：不使蛋蛋白质凝凝固，形形成透明明的凝胶胶。苦味酸、升升汞、铬铬酸、碘碘均能使使胞质蛋蛋白和核核蛋白凝凝固；酒酒精能沉沉淀胞质质蛋白，而而核蛋白白沉淀后后溶于水水；醋酸不能能凝固胞胞质蛋白白但能凝凝固核蛋蛋白;福尔马马林、锇锇酸、重重铬酸钾钾对两种种蛋白都都不凝固固。 1.凝结型型固定液液：（1）酒精精:(aalcooholl)700%-775%酒酒精渗透透力最强强。特点：穿穿透速度度快。可沉淀白白蛋白、球球蛋白和和核蛋白白，前两两者所生生成的沉沉淀不溶溶于水，核核蛋白所所生成的的沉淀溶溶于水；所以经经乙醇固固定的标标本对核核的染色色不良，不不适于对对染色体体的固定定。浓度500%以上上的酒精精可溶解解脂肪和和类脂体体。不能能用于膜膜结构的的研究，溶溶解血色色素，破破坏其他他多种色色素，所所以不能能用于脂脂肪、类类脂类和和色素的的固定。一一般用于于组织学学观察。使糖原沉沉淀，但但能溶于于水。是还原剂剂，在混混合固定定液中，酒酒精不能能与氧化化固定液液混用。如如铬酸、锇锇酸、重重铬酸钾钾等。使材料硬硬化、组组织收缩缩明显。固定材料料适宜浓浓度为770%-1000%。固固定后不不需冲洗洗，700%的酒酒精可较较长时间间保存， 若长期期保存材材料与甘甘油等量量混合后后使用。770%酒酒精：甘甘油=1：11（2）醋酸酸（accetiic aacidd）特点：穿穿透力速速度极快快。能固定核核蛋白，对对胞质也也存在固固定作用用。对核核蛋白是是凝结型型固定液液，对胞胞质是非非凝结型型固定液液。使染染色质和和染色体体的固定定和染色色均很好好，因此此所有固固定染色色体的固固定液中中几乎都都有醋酸酸。对脂类和和糖类无无固定作作用。酸性对材料不不但不硬硬化还有有软化作作用。对对细胞无无收缩作作用，稍稍有膨胀胀作用。可防止其他药剂如乙醇、甲醛、铬酸等引起组织收缩。固定后不不需冲洗洗，可直直接投入入70%的酒精精中保存存。固定材料料适宜浓浓度为00.3%-5%。（3）铬酸酸（chhrommic aciid）特点：穿穿透速度度缓慢。能沉淀所所有蛋白白质，凝凝固核酸酸，增强强核的着着色能力力，可作作为核蛋蛋白核核核酸的固固定液。能固定高尔基体及线粒体。常用于细胞学观察。只有铬酸酸能真正正固定肝肝糖原，使使之不溶溶于水。对脂类无影响；氧化剂，不不能与酒酒精混用用。固定定后投入入酒精前前必须用用流水冲冲洗，直直至组织织中不含含铬酸为为止，如如冲洗不不干净或或直接投投入酒精精中，被被还原成成绿色的的氧化铬铬并发生生沉淀，使使染色困困难。使组织硬硬化，细细胞收缩缩。铬酸常配配成2%或100%的水水溶液作作为储备备液，固固定适宜宜浓度为为0.55%-11%。（4）苦味味酸（ppicrric aciid）三三硝基苯苯酚，不不能结晶晶保存，要要以饱和和溶液存存放。干干燥时易易爆炸。特点：穿穿透速度度中等。可沉淀一一切蛋白白质。对对脂类无无影响，对对糖类无无固定作作用。细胞收缩缩明显，材材料硬化化程度很很小。固定后不不需冲洗洗，可直直接投入入70%酒精中中洗去黄黄色。固定材料料适宜浓浓度为饱饱和溶液液，即00.9%-1.2%。2.非凝结结型固定定液：（质质量较好好）（1）锇酸酸（OssO4）特点：穿穿透速度度很慢。材材料要切切的小一一些，约约1mmm3。不沉淀蛋蛋白质，能能使蛋白白质被均均匀固定定，所以以用锇酸酸固定的的蛋白质质能保持持生活时时的均匀匀性。是脂肪和和类脂类类的很好好的固定定剂 。强氧化剂剂，易挥挥发，毒毒性大，对对视网膜膜固定效效果好，要要保护好好眼睛。价价格贵。不使细胞胞收缩，对对细胞质质固定好好，固定物物组织柔柔软。固定后流流水冲洗洗1224小小时。使使其完全全洗净，否否则遇乙乙醇就发发生沉淀淀。固定材料料适宜浓浓度为00.5-2%。锇酸的配制制：用重重蒸水配配成母液液2%，使使用时，用用PH77.0、00.2MM磷酸缓缓冲液稀稀释一倍倍到1%。（2）戊二二醛：特点：穿穿透速度度很快。固定微管管蛋白，是是微管的的很好的的固定液液。用PH66.8-7.00、0.2MM磷酸缓缓冲液配配成255%母液液，固定定材料适适宜浓度度为3-6%。（3）丙烯烯酸：特点：固固定蛋白白、核酸酸和聚多多糖。固定材料料适宜浓浓度为110%，用用PH66.5的的磷酸缓缓冲液配配。（4）甲醛醛：（不不用于电电镜制片片）特点：穿穿透速度度快。可与蛋白白质化合合形成不不溶性的的化合物物而固定定，固定定脂肪和和类脂类类化合物物。还原剂，不不能与氧氧化剂混混用。组织硬化化程度显显著，收收缩小，但但仅仅经经酒精脱脱水后，收收缩显著著。固定后不不需水洗洗，可直直接投入入70%的酒精精。但经经长期固固定的材材料，需需经流水水冲洗11-2天天，否则则影响染染色。市售的为为37-40%甲醛，称称为福尔尔马林，固固定和保保存材料料的适宜宜浓度是是10%福尔马马林。（四）混合合固定液液：1.卡诺(Carrnoyy)氏固固定液：配方：纯酒酒精：冰冰醋酸=3：11此液适于固固定一般般动物组组织和肝肝糖原以以及植物物组织。（多多用于细细胞学研研究。）穿穿透速度度快，为为防止组组织硬化化，固定定时间不不要超过过24小小时。时时间以材材料的不不同而有有所区别别，根尖尖15mmin,花药11小时。糖糖原在33-5下固定定4消失失，小白白鼠睾丸丸30-50mmin。固固定后可可转入770%中中保存，也也可直接接经955%酒精精，纯酒酒精脱水水。2.福尔马马林-醋醋酸-酒酒精混合合液：（FFAA）配方：500%或770%酒酒精 90mml、冰冰醋酸 5mml、福福尔马林林 5mml配方中福尔尔马林及及冰醋酸酸的含量量，经常常根据材材料而略略加改变变。一般般容易引引起收缩缩的材料料应多加加冰醋酸酸而减少少福尔马马林的含含量；坚坚硬的材材料可略略减少冰冰醋酸而而增加福福尔马林林。至于于酒精的的浓度应应用的原原则是：柔弱幼幼嫩的材材料用低低浓度，老老年或坚坚硬材料料用700%酒精精。如用作植物物胚胎材材料则其其配方可可改为：50%酒精精 889mll、冰醋醋酸 66ml、福福尔马林林 5mmlFAA是一一种良好好的固定定液和保保存液，差差不多一一般植物物组织和和器官都都适用。（适适用于组组织学观观察，不不适于细细胞学观观察。）固固定时间间一般224小时时，也可可在此液液中长期期保存。也也可通过过50%酒精、770%酒酒精开始始脱水。木质小枝枝枝必须固定1周。固定后木质材料应在流水中冲48小时，并在50%酒精和甘油溶液（1：1）中浸2-3天，使其软化。3.铬酸-醋酸中中液：配方100%铬酸酸水溶液液 7mml 、110%醋醋酸水溶溶液 110mll、蒸馏馏水加至至1000ml。此液用于固固定根尖尖、小的的子房及及分离出出来的胚胚珠等植植物组织织。固定定时间一一般122-244小时，不不能长期期保存材材料。固固定后流流水冲洗洗12-24小小时。4.纳瓦兴兴氏液：（适用用于组织织学和细细胞学研研究）甲乙液分开开配，临临用时再再混合。配法为：表1-4纳纳瓦兴氏氏液的配配方常备液纳瓦兴氏液液桑弗利斯甲液1%铬酸10%铬酸酸10%醋酸酸冰醋酸蒸馏水15107540154540204060408603210702013879乙液福尔马林蒸馏水4060109010902080208030706436纳瓦兴氏液液，固定定时间为为24-48小小时，如如固定液液呈暗绿绿色时，表表示固定定能力已已经消失失，其中中铬酸被被还原的的缘故，仅仅有保存存作用，固固定后用用70%酒精冲冲洗，再再脱水。纳瓦兴氏液液，固固定时间间为122-488小时，固定后用水冲洗，可用35%酒精冲洗，可用70%酒精冲洗。桑弗利斯液液，固定定时间为为4-66小时，流流水冲洗洗6-112小时时。（五）固定定时应注注意的问问题：1.固定的的材料越越新鲜越越好，立立即固定定。2.材料与与固定液液比例一一般为11：200。3.根据材材料的性性质和制制片的目目的选择择固定液液。4.有时要要用蔗糖糖、氯化化钠来调调节渗透透压。5.材料外外表有毛毛或其他他不易穿穿透的物物质存在在，可先先在含酒酒精的固固定液中中固定几几分钟，再再换用含含水的固固定液。6.含有气气体的材材料投入入固定液液后，不不下沉，须须将气体体抽出。方方法可采采用真空空泵，或或用注射射器的简简易方法法（将材材料和固固定液倒倒入100ml注注射器中中，插入入活塞，用用手封住住出口，用用手来回回抽拉几几次即可可）。7.材料固固定后一一定要做做标记。三、冲洗：（一）目的的：所谓谓洗涤，即即用洗涤涤剂渗透透到材料料中，把把固定剂剂洗掉，洗洗涤必须须彻底，才才能进行行下一步步操作。否否则留在在组织中中的固定定液有的的防碍染染色，有有的会发发生沉淀淀物或结结晶而影影响观察察，有的的可以继继续发生生作用，破破坏材料料或影响响以后的的处理。（二）洗涤涤的原则则与方法法：常用的洗涤涤剂是水水和低浓浓度的乙乙醇。1.固定液液用水配配的，就就用水或或流水来来冲洗；不需流流水冲洗洗的材料料，放在在小瓶内内，换数数次水，每每次1-2小时时。2.用各种种浓度的的酒精配配的，就就要用与与固定液液相近浓浓度的酒酒精冲洗洗；材料料：酒精精=1：10。3.用福尔尔马林固固定的不不用水洗洗，但长长期固定定的，应应充分水水洗，否否则影响响染色。4.用铬酸酸、重铬铬酸钾等等固定的的材料就就用流水水冲洗。将将材料放放在广口口瓶内，瓶瓶口用纱纱布扎起起，橡皮皮管一端端接在水水龙头上上，一端端插入瓶瓶底，调调节水的的流量，是是瓶内的的水不断断更新。水水流不要要太猛，以以免损坏坏材料。冲冲洗时间间应和固固定时间间相同或或再长。5.冲洗时时间要根根据固定定液及材材料的性性质、大大小而定定，一般般1-66小时。四、脱水：就是用用一种药药剂把材材料中的的水份全全部代替替干净。（一）脱水水原因：在制作作永久制制片时，组组织冲洗洗完毕后后必须进进行脱水水，因组组织固定定和水洗洗后含大大量水分分，而水水不能和和石蜡包包埋剂混混合，组组织内只只要有极极少量水水份，就就会防碍碍包埋剂剂的渗入入。第一步脱水水：是为为了引入入包埋剂剂作准备备。第二步脱水水：是为为了引入入封藏剂剂作准备备。（二）脱水水的结果果：使材料变硬硬，形状状更加稳稳定，利利于组织织永久保保存。除除尽材料料的水份份，才能能使透明明剂、包包埋剂、封封藏剂渗渗透到组组织中，有有利于组组织的透透明和透透蜡。（三）脱水水的方法法：脱水应逐步步进行，而而不能骤骤然进行行，否则则会引起起组织的的强烈收收缩，或或使材料料变形。一一般把脱脱水剂配配成各种种浓度，材材料自低低浓度到到高浓度度依次经经各级脱脱水剂，其其中所含含水份逐逐渐被脱脱水剂取取代。（四）脱水水剂应具具备的两两个特性性：1.必须是是亲水性性，能与与水以任任何比例例混合，代代替细胞胞中的水水份。2.必须能能和其他他有机溶溶剂混溶溶取代。（五）脱水水剂分为为两类：1.非石蜡蜡溶剂的的脱水剂剂：如乙乙醇、丙丙酮等，组组织脱水水后必须须经二甲甲苯透明明才可浸浸蜡。2.石蜡溶溶剂的脱脱水剂：如正丁丁醇、二二氧六圜圜等，组组织脱水水后即可可直接透透蜡，不不需经过过中间溶溶剂二甲甲苯之类类的药品品。（六）常用用的脱水水剂：1.乙醇：（1）按浓浓度梯度度依次进进行155%35%50%70%83%95%1000%1000%；（2）脱水水时的注注意事项项：脱水必须须要在有有瓶盖内内进行，尤尤其是高高浓度乙乙醇很容容易吸收收空气中中的水份份。组织由低低浓度向向高浓度度的乙醇醇转移时时，要用用吸水纸纸吸干余余液，以以免将水水份带入入。纯乙醇中中如有水水，可加加无水硫硫酸铜以以吸去水水份。（3）在各各级停留留的时间间：第一步脱水水，须看看材料的的性质大大小而定定，体积积为2mmm3的一般般每级为为1-44小时；第二步切片片脱水，每每级只需需3-110miin；在在低浓度度酒精中中，每级级停留的的时间不不易过长长，否则则易使组组织变软软，助长长材料解解体。从从95%到1000%乙乙醇后，时时间不能能太长，否否则材料料变硬变变脆，影影响切片片。为使使乙醇脱脱水彻底底，应更更换两次次1000%乙醇醇。如需需过夜应应停留在在70%酒精中中。注：在每级级中停留留的时间间，依照照材料的的大小、性性质以及及留在固固定液中中的时间间长短和和固定液液的溶解解性而定定。如洋葱、蚕蚕豆等根根尖和小小片叶子子一样大大小的材材料，每每级停留留约300minn-1hh。若用用苦味酸酸固定则则可延长长为1hh。由FAAA固定的的草本茎茎，每级级停留22小时，木木本茎停停留4小小时，较较大的木木材每级级延长为为8-112小时时。一般动物物组织如如小白鼠鼠的肾脏脏2-44mm厚厚，每级级停留11-2hh。脱水至纯纯酒精时时，需更更换两次次，每次次30mmin-1h；材料大大者，可可多换一一次。由由95%-1000%时时，瓶子子上的塞塞子也应应换干燥燥的，以以免水份份渗入。2.丙酮：为很好好的脱水水剂，可可以代替替乙醇，其其作用和和用法和和乙醇相相似，不不过其脱脱水力和和收缩力力都比乙乙醇强。能能使蛋白白沉淀，组组织硬化化，不能能溶解石石蜡，所所以仍需需经过二二甲苯或或其他透透明剂，然然后才能能进行浸浸蜡和包包埋。3.正丁醇醇：此剂剂易挥发发，可与与水和乙乙醇混合合，亦是是石蜡溶溶剂，可可不经透透明剂直直接浸蜡蜡。但一一般在应应用上还还未能完完全替代代乙醇。多多与乙醇醇按一定定比例混混合作脱脱水之用用，但最最后需经经纯正定定醇方可可浸蜡。很很少引起起组织块块的收缩缩，变脆脆。表1-5各各级浓度度的正丁丁醇：级别（ml）（ml）（ml）（ml）（ml）（ml）蒸馏水503015500乙醇40505040250正丁醇1020355575100-中的的乙醇可可用955%，仅仅级的用用纯乙醇醇配。中可过过夜。材材料经两两次正丁丁醇后，进进入1/2正丁丁醇1/2石蜡蜡，经11-3小小时后，转转入纯石石蜡。4.叔丁醇醇:可与与水，乙乙醇及二二甲苯等等剂混合合，(可可套用上上表)也也可单独独使用，是是一种应应用很广广的脱水水剂。此此液不会会使组织织收缩或或变硬，不不必经过过透明，可可直接浸浸蜡。应应用此剂剂可以简简化脱水水、透明明等步骤骤。因此此已逐渐渐代替乙乙醇，但价格格较贵。表1-6各各级浓度度的叔丁丁醇：级别（ml）（ml）（ml）（ml）（ml）（ml）蒸馏水403015000乙醇50505050250正丁醇1020355075100-中的的乙醇可可用955%，仅仅级的用用纯乙醇醇配。材材料经两两次叔丁丁醇后，进进入1/2叔丁丁醇1/2石蜡蜡，经11-3小小时后，转转入纯石石蜡。举例：植物物骨架光光镜观察察的实验验中，若若遇到效效果好的的片子，可可通过以以下步骤骤做成永永久切片片：500%乙醇醇70%95%1/2295%：1/2叔丁丁醇叔丁醇醇中性树树胶（每每级5-10mmin）。5.甘油，也也是一种种良好的的脱水剂剂，尤其其对细小小柔软的的材料更更适合。用用甘油脱脱水可以以避免原原生质收收缩，但但脱水前前必须洗洗净固定定剂，以以免影响响包埋和和染色。利利用甘油油脱水，可可以从550%浓浓度开始始至纯甘甘油，再再换纯乙乙醇。 6.二氧六六环：为为无色液液体，易易挥发燃燃烧，且且有毒，应应尽力避避免吸入入它的蒸蒸气。能能与水和和乙醇在在任何比比例下混混合，为为石蜡溶溶剂，脱脱水至纯纯二氧六六环后，即即可进行行包埋。浓浓度梯度度设计为为：300%50%70%90%1000%1000%1000%每级级时间为为1-66小时。五、透明：材料经脱水水剂去水水分后，还还要经过过一种既既能与脱脱水剂，又又能与包包埋剂相相混合的的溶剂透明剂剂来处理理，以便便于包埋埋剂的深深入或封封藏。在在制片过过程中有有两次透透明：第第一次是是组织块块的透明明，为了了引入包包埋剂。第第二次是是染色以以后切片片的透明明。为了了引入封封藏剂。（一）常用用透明剂剂：透明明剂都是是石蜡的的溶剂，绝绝大多数数不能与与水混合合，最常常用的透透明剂有有二甲苯苯，苯，甲甲苯，氯氯仿，冬冬青油等等。1.二甲苯苯：目前前应用最最广。易易溶于乙乙醇，又又能够溶溶解石蜡蜡，加拿拿大树胶胶，透明明力强，作作用较快快。其最最大缺点点是容易易变硬变变脆.材材料必须须脱尽水水分再透透明，否否则发生生乳状浑浑浊。在玻片进入入二甲苯苯前，为为了减少少材料收收缩，材材料先经经过1/2二甲甲苯+11/2无无水乙醇醇二甲苯苯（I）二甲苯（II）1/2二甲苯+1/2石蜡材料在二甲甲苯中时时间不宜宜过长，否否则材料料收缩变变硬，变变脆。一一般组织织块透明明总时间间1-33小时，（每每级300分钟左左右）染染色后的的切片透透明每级级5-110分钟钟。2.甲苯：性质同同二甲苯苯，可作作为二甲甲苯的替替代品