《分子生物学检验技术》实验指导chw.docx

实验一小小鼠肝组组织DNNA的提提取及鉴鉴定【实验目目的】1、 掌握动物物组织DDNA提提取的方方法；2、 掌握紫外外分光光光度法检检测、鉴鉴定DNNA浓度度和纯度度的方法法。【实验原原理】获得相当当纯度和和完整性性的基因因组DNNA，可可用于DDNA酶酶切图谱谱、多态态性分析析、基因因诊断、构构建基因因组文库库等。因因此，DDNA样样品质量量的好坏坏将直接接关系到到实验的的成败。较较理想的的DNAA样品应应达到以以下三点点要求：不应存存在对酶酶有抑制制作用的的有机溶溶剂和过过高浓度度的金属属离子；最大程程度地降降低蛋白白质、多多糖和脂脂类分子子的污染染；排除RRNA分分子的污污染和干干扰。DNA以以核蛋白白形式存存在于细细胞中，提提取DNNA的原原则是即即要将DDNA与与蛋白质质、脂类类和糖类类等成分分分离，又又要保持持DNAA分子的的完整。本本实验中中，用阴阴离子去去垢剂十十二烷基基磺酸钠钠（SDDS）消消化破裂裂细胞膜膜、核膜膜，并使使组织蛋蛋白变性性沉淀，DDNA从从核蛋白白中游离离分开；为控制制组织中中脱氧核核糖核酸酸酶（DDNasse）对对DNAA的降解解，加入入柠檬酸酸钠或乙乙二胺四四乙酸二二钠（EEDTAANaa2）以除去去激动该该酶的金金属离子子，SDDS也能能使DNNasee变性失失活；蛋蛋白酶KK可水解解蛋白质质，消化化DNAA酶；分分离后的的DNAA用饱和和酚/氯氯仿抽提提除去蛋蛋白质，接接着用氯氯仿抽提提以除去去DNAA溶液中中微量酚酚的污染染；最后后用无水水乙醇沉沉淀DNNA，得得到欲提提取的基基因组DDNA。260nnm处DDNA有有最大吸吸收峰，测测DNAA的A2260，可可计算其其浓度。而而蛋白质质在2880nmm处有最最大吸收收峰，可可测定AA2600nm/A2880nmm比值，检检测DNNA的纯纯度，该该比值介介于1.822.0之之间。【实验器器材和试试剂】1、动物物小白鼠2、设备备移液器、台式离离心机、水浴箱箱、陶瓷研研钵等；7511紫外分分光光度度计、石石英比色色皿、洗洗瓶、滤滤纸等。3、试剂剂（1）基基因组DDNA提提取试剂剂盒（北北京康为为世纪生生物科技技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生生理盐水水，4贮存（8）无无水乙醇醇、700%乙醇醇【操作步步骤】1、制备备肝匀浆浆迅速处死死小白鼠鼠，称取取新鲜肝肝脏组织织50 mmg，用用预冷生理盐盐水洗去去血液，滤滤纸吸干干后剪碎碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 l Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 l蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55孵育直到组织溶解（约1小时）。2、提取取DNAA（1）加加入1.5 l RRNasse AA，颠倒倒混匀，337孵育115-660 mmin。（2）冰冰上孵育育1分钟钟使样品品迅速冷冷却。（3）加加入1/3体积积的Buuffeer PPP，涡涡旋震荡荡20 s，1120000 rrpm离离心3 minn。（4）将将上清转转移到个新的的离心管管中，加加入等体体积异丙丙醇，轻轻轻颠倒倒混匀，可可见絮状状沉淀（纤纤维状DDNA）从从溶液中中析出。1120000 rrpm离离心1 minn，弃上上清。（5）加加入3000 l 770乙乙醇，颠颠倒数次次以洗涤涤DNAA沉淀。1120000 rrpm离离心1 minn，弃上上清，室室温干燥燥15 minn。（6）加加入500 l BBufffer GE溶溶解DNNA（如如果DNNA的量量比较大大，可以以65孵育以以促进DDNA的的溶解），室温保存待测。3、DNNA浓度度和纯度度的测定定取0.11 mll DNNA样品品，加蒸馏水水至1 ml，在在7511紫外分分光光度度计上测测A2660值和和A2880值。计算：DDNA浓浓度（g/mml）=A2600×500×100（请问系系数500、100是如何何得来的的？）DNA纯纯度=A2600nm/A2880nmm【注意事事项】（1）由由于DNNA主要要存在于于细胞核核内，为为便于提提取DNNA，肝肝脏的破破碎要严严格控制制好。即即要尽可可能的将将细胞膜膜破碎，又又要尽可可能多保保留完整整的细胞胞核，以以保留660770的的完整细细胞核为为宜。为为避免DDNA过过度断裂裂，不宜宜用电动动研磨器器制备匀匀浆。在提取过过程中，染染色体会会发生机机械断裂裂，产生生大小不不同的片片段，因因此分离离基因组组DNAA时应尽尽量在温温和的条条件下操操作，如如尽量减减少酚/氯仿抽抽提，混混匀过程程要轻缓缓, 以以保证得得到较长长的DNNA。（2）用用氯仿除除去组织织蛋白，要要不断振振荡使蛋蛋白质变变性。如如要得到到高纯度度DNAA，可加加入蛋白白酶K降降解蛋白白质。（3）酚酚和氯仿仿均有很很强的腐腐蚀性，操操作时应应避免接接触皮肤肤。（4）室室温下干干燥时尽尽可能使使残留的的乙醇挥挥发掉（DDNA中中残留的的乙醇会会影响内内切酶的的活性或或电泳时时DNAA不下沉沉），但但不要让让DNAA完全干干燥，否否则极难难溶解，DDNA溶溶解过程程通常需需要122-244hr。（5）提提取过程程应尽量量保持低低温。（6）在在波长2260nnm紫外外线下，11OD的的光密度度值相当当于双链链DNAA浓度为为50g/mml；单单链DNNA或RRNA为为40g/mml；单单链寡核核苷酸为为20g/mml。据据此来计计算核酸酸样品的的浓度。紫紫外分光光光度法法只用于于测定浓浓度>00.255g/ml的的核酸溶溶液。（7）AA2600nm/A2880nmm比值应应介于11.82.00之间，若若比值>>2表示示DNAA样品中中含有较较多的RRNA，如如比值<<1.88表明样样品中有有蛋白质质污染。应应根据后后续实验验要求，采采取不同同的方法法纯化。当当然也会会出现DDNA溶溶液中既既含蛋白白质又含含RNAA，其比比值介于于1.882.0的情情况，所所以有必必要结合合凝胶电电泳等方方法鉴定定有无RRNA，或或用测定定蛋白质质的方法法检测是是否存在在蛋白质质。【结果】1、A2260 = ，AA2800 = 。2、小鼠鼠肝组织织中DNNA浓度度是gg/mll。3、小鼠鼠肝组织织中DNNA的AA2600nm/A2880nmm比值是是。【思考题题】1、 提取和纯纯化的真真核组织织DNAA有何用用途？2、 你的A2260nnm/AA2800nm比比值结果果是否介介于1.822.0之之间？有有何意义义？3、 请结合你你的实验验结果和和操作步步骤，分分析如何何检测和保证DNNA的质质量？实验二聚聚合酶链链反应【实验目目的】 采用聚聚合酶链链式反应应技术扩扩增小鼠鼠肝组织织平滑肌肌收缩蛋蛋白（SSM222）基因因【实验原原理】聚合酶链链式反应应（pollymeerasse cchaiin rreacctioon，PPCR）用于体体外扩增增位于两两段已知知序列之之间的DDNA区区段（靶序列列）。其原原理是通通过耐热热DNAA聚合酶酶催化的的DNAA合成反反应达到到对靶序序列的扩扩增。反反应中使使用两条条化学合合成的寡寡核苷酸酸作为引引物，分分别与模模板DNNA两条条单链互互补，待待扩增序序列片段段位于两两条引物物之问。PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参与。反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下，使引物能与靶序列形成杂交双链（退火）。当温度升至72左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3端，使互补链从5 向3方向不断延伸，直至形成新的DNA双链。通过变性、退火和延伸的一个循环可以使靶序列的分子拷贝数增加一倍。由于每次扩增的产物又作为下一次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，一个分子的模板经过n个循环可得2n个分子拷贝产物。本实验扩扩增的是是小鼠肝肝组织平滑滑肌收缩缩蛋白（SSM222）基因因，扩增增产物片片段大小小为5441bpp。扩增增所用的的上游引引物序列列为：55-AGTTTATTATTTAATTTTTTGCAATAGGTGCCCTGGGTTTG-33，下游游引物序序列为：5-GCGGCTAAGCTTACAAAGGGCTTTGGTTCGTTTTGG-3。【实验器器材和试试剂】1、设备备PCR仪仪、0.2mll PCCR反应应管、11.5mml离心心管、移移液器、吸吸嘴、旋旋涡混合合器。2、试剂剂（200 l体系系）PCR试试剂盒（北北京康为为世纪生生物科技技公司）【操作步步骤】1、 分别在PPCR反反应管中中加入22× PPCR mixx 100 l、上上游和下下游引物物各2 l、DDNA 2 l和HH2O 44 l。2、 把PCRR反应管管放人PPCR仪仪，按仪仪器操作作要求启启动扩增增程序。本本实验的的扩增程程序为：94预变性性5分钟钟后进入入循环扩扩增，即即94变性330s，558退火330s，772延伸11 miin。重重复355个循环环后，于于72再延伸伸10 minn，最后后4保温。3、 反应结束束后，将将PCRR反应管管于1220000 rppm离心心15ss，取扩扩增产物物进行电电泳分析析。【注意事事项】1、由于于PCRR技术的的灵敏度度高，极极微量的的污染也也会造成成扩增的的假阳性性结果。因因此，必必须采取取相应措措施避免免发生污污染。2、PCCR实验验应设立立阴性对对照反应应，即在在反应体体系中不不加模板板DNAA。3、多份份样品同同时扩增增时，可可配制总总的反应应混合液液，并分分装于PPCR管管中，然然后再在在各管中中分别加加入模板板。4、临床床诊断用用PCRR反应必必须在专专门的PPCR实实验室中中进行，实实验室应应包括试试剂配制制室、模模板制备备室、PPCR扩扩增室和和产物检检测室等等功能区区。PCCR实验验中的各各个步骤骤应在相相应的功功能区中中进行。5、PCCR试剂剂与模板板DNAA及样品品应分别别保存于于不同功功能区的的冰箱中中。6、操作作时应戴戴手套，配配制反应应体系和和加模板板时应分分别使用用专用的的移液器器，所有有耗材使使用前必必须经高高压灭菌菌，用后后按规定定处理并并丢弃在在指定容容器中。【结果】【思考题题】1、 PCR各各组分在在反应中中的作用用是什么么？2、 降低退火火温度、延延长变性性时间会会对反应应有何影影响？实验三 琼脂脂糖凝胶胶电泳【实验目目的】掌握琼脂脂糖凝胶胶电泳分分离DNNA的原原理和方方法。【实验原原理】带电荷的的物质在在电场中中的趋向向运动称称为电泳泳。电泳泳的种类类多，应应用非常常广泛，它它已成为为分子生生物学技技术中分分离生物物大分子子的重要要手段。琼琼脂糖凝凝胶电泳泳由于其其操作简简单、快快速、灵灵敏等优优点，已已成为分分离和鉴鉴定核酸酸的常用用技术。DNA 分子在在琼脂糖糖凝胶中中泳动时时有电荷荷效应和和分子筛筛效应。DDNA 分子在在高于等等电点的的pH 溶液中中带负电电荷，在在电场中中向正极极移动。在相同的的电泳条条件下（如凝胶胶浓度、电电流、电电压、缓缓冲液等等），DNNA 分分子的迁迁移速度度取决于于分子筛筛效应，即即DNAA分子本本身的大大小和构构型。具具有不同同的相对对分子质质量的DDNA 片段泳泳动速度度不一样样，可进进行分离离。凝胶胶电泳不不仅可分分离不同同相对分分子质量量的DNNA ，也也可以分分离相对对分子质质量相同同，及构型不不同的DDNA 分子。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。荧光染料料溴化乙乙锭(EEB)能能插入DDNA分分子中形形成复合合物，紫紫外光照照射下EEB能发发射荧光光，而且且荧光的的强度正正比于核核酸的含含量。由由于EBB是致癌癌剂，现在开发发出了安安全的染染料，如如Sybber Greeen、GGelRRed、GGolddVieew等。【仪器与与试剂】1. 仪仪器天平、锥锥形瓶、微微波炉（或或电炉）、制制胶板、电电泳仪、水水平电泳泳槽、凝凝胶成像像分析仪仪（或紫紫外线透透射仪）、微微量可调调移液器器、移液液管、量量筒、一一次性塑塑料手套套。2. 试试剂（1）550×TAEE电泳缓冲冲液：Triis碱2422.0g、冰乙酸酸57.1 mml、EDTTA 663.55g、NaOOH 110.00g，加蒸馏馏水至110000 mll，使用前前用蒸馏馏水稀释释至1×TAE电泳缓冲冲液。（2）66×loaadinng bbufffer ：( 0.225溴溴酚蓝，00.255%二甲甲苯氰FFF，330%甘甘油水溶溶液)或或（0.25溴酚蓝蓝，400(ww/v)蔗糖水水溶液），贮贮存于44。（3）电电泳级琼琼脂糖（Agarose）、溴化乙锭（母液:将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可）、DNA Marker、DNA、蒸馏水。【实验步步骤】1配制制1.55的琼琼脂糖凝凝胶：精确称取取1.55g电泳泳级琼脂脂糖，加加入1000 mll 1×TAEE电泳缓缓冲液，在在微波炉炉里（或或电炉）加加热使琼琼脂糖颗颗粒完全全溶解（加热时时应盖上上封口膜膜，以减少少水份蒸蒸发），待胶冷却却至555ºC左右右时，加加入200µl溴化乙乙锭（也可先不加EBB，而是电电泳后再再用0.5µgg/ml的EB 溶液浸浸泡染色色），轻轻轻旋转混混匀。插插入合适适的梳子子，将溶溶液倒入入制胶板板中，待凝结后后拔去梳梳子待用用。2. 加加样：将凝胶置置于电泳泳槽，加加入1×TAEE电泳缓缓冲液覆覆盖胶面面即可。各取PCRR产物和和DNAA分子量量参照物物10 µlDNNA加入入1µll 6×loaadinng bbufffer，混混合后上上样，分分别加入入琼脂糖糖凝胶孔孔内。加加样时切切勿破坏坏点样孔孔周围的的凝胶。3. 电电泳：合上电泳泳槽盖，打开电电泳仪，控制电压保持在60-80V，电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。4. 染染色：未加EBB的胶板板在电泳泳完毕后后移入00.5g/mml的EB溶液液中，室温下下染色220-225 分分钟。5. 观观察和拍拍照：电泳完成成后切断断电源，取取出凝胶胶，置于于凝胶成成像分析析仪上观观察电泳泳结果，并并照相记记录。或或在波长长为2554nmm的紫外外灯下观观察DNNA的荧荧光条带带。紫光光灯下观观察时应应戴上防防护眼镜镜或有机机玻璃面面罩，以免损损伤眼睛睛。【注意事事项】1影响响DNAA在琼脂脂糖凝胶胶中迁移移速率的的因素：（1）DDNA大大小：迁移速速率与llogNN成反比比（N为为碱基对对数目）。分分子越大大，迁移移越慢。分子量相同的空间结构越紧密的电泳越快，如超螺旋>线性DNA。（2）琼琼脂糖凝凝胶浓度度：不同同的凝胶胶浓度，分分辨不同同范围的的DNAA ：琼脂糖凝凝胶浓度度可分辨的的线性DNNA片段段大小（kb）0.5%56000.7%0.8121.0%0.461.5%0.241.755%0.232.00.13（3）DDNA构构象：一一般迁移移速率超超螺旋环环状>线状DDNA>>单链开开环。当当条件变变化时，情情况会相相反，还还与琼脂脂糖的浓浓度、电电流强度度、离子子强度及及EB含含量有关关。（4）所所加电压压：低电电压时，线线状DNNA片段段的迁移移速率与与所加电电压成正正比。使使分辨效效果好，凝凝胶上所所加电压压不应超超过200V/ccm，电电泳温度度应该低低于300。（5）嵌嵌入染料料的存在在：降低低线性DDNA迁迁移率（不提倡倡加在电电泳液中中）。（6）电电泳缓冲冲液（00.5××TBEE）的组组成及其其离子强强度影响响DNAA的迁移移率。无离子子存在时时，核酸酸基本不不泳动；离子强强度过大大产热厉厉害，熔熔化凝胶胶并导致致DNAA变性。一般采采用1××TAEE，1××TBEE，1××TPEE（均含含EDTTA ppH8.0）。2溴化化乙锭（EEB）为为致癌剂剂，操作作时应戴戴手套，尽尽量减少少台面污污染，凡是沾沾污了EEB的容容器或物物品必须须经专门门处理后后才能清清洗或丢丢弃。3电泳泳指示剂剂：核酸酸电泳常常用的指指示剂有有两种，溴溴酚蓝（bbrommophhenool bbluee, BBb）呈呈蓝紫色色；二甲甲苯晴（xxyleene cyaanoll, XXc）呈呈蓝色，它它携带的的电荷量量比溴酚酚蓝少，在在凝胶中中的的迁迁移率比比溴酚蓝蓝慢。【实验结结果与分分析】1电泳泳过程中中，你自自己或本本组所采采用的电电压为_伏特特（v），电电流为_毫安（mmA），通通电时间间为_分分钟。 2在在实验报报告上描描画自己己或实验验组的电电泳图谱谱，标明阳阳极和阴阴极位置置。【思考题题】你的电泳泳结果如如何？成成功或失失败有哪哪些方面面的原因因？进行行琼脂糖糖凝胶电电泳时应应注意哪哪些问题题？- 14 -