14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵270.docx

第十三章 基因工程菌的发酵近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。第一节 工程菌菌的来源源和应用用一、何谓基基因工程程基因工程（gennetiic eengiineeerinng）是是指在基基因水平平上，采采用与工工程设计计十分类类似的方方法，根根据人们们的意愿愿，主要要是在体体外进行行基因切切割、拼拼接和重重新组合合，再转转入生物物体内，产产生出人人们所期期望的产产物，或或创造出出具有新新的遗传传特征的的生物类类型，并并能使之之稳定地地遗传给给后代。基因工程的的核心技技术是DDNA的的重组技技术。重重组即利利用供体体生物的的遗传物物质或人人工合成成的基因因，经过过体外或或离体的的限制酶酶切割后后与适当当的载体体连接起起来形成成重组DDNA分分子，然然后在将将重组DDNA分分子导入入到受体体细胞或或受体生生物构建建转基因因生物，该该种生物物就可以以按人类类事先设设计好的的蓝图表表现出另另外一种种生物的的某种性性状。除除DNAA重组技技术外，基基因工程程还应包包括基因因的表达达技术，基基因的突突变技术术，基因因的导入入技术等等。基因工程一一般分为为4个步骤骤：一是取得符符合人们们要求的的DNAA片段，这这种DNNA片段段被称为为“目的基基因”；二是是将目的的基因与与质粒或或病毒DDNA连连接成重重组 DDNA；三是把把重组DDNA引引入某种种细胞；四是把把目的基基因能表表达的受受体细胞胞挑选出出来。 DNAA 分子子很小，其其直径只只有200埃，约约相当于于五百万万分之一一厘米，在在它们身身上进行行“手术”是非常常困难的的，因此此基因工工程实际际上是一一种“超级显显微工程程”，对 DDNA的的切割、缝缝合与转转运，必必须有特特殊的工工具。 要要把目的的基因从从供体 DNAA长链中中准确地地剪切下下来，可可不是一一件容易易的事。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶，它能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以完整地切下个别基因。自70年代以来，人们已经分离提取了 400多种“分子剪刀”。有了形形色色的“分子剪刀”，人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割了。DNA的分子链被切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976年，科学们在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接起来，修复好DNA链的断裂口。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。从此，DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种 DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。把“拼接”好的 DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的 DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒，因为质粒能自由进出细菌细胞，应当用“分子剪刀”把它切开，再给它安装上一段外来的 DNA片段后，它依然如故地能自我复制。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就可以如愿以偿了。运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步，目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒PSC100作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。 二、工程菌菌的获得得1，确定目目的产物物。2，找出产产该产物物的细胞胞。3，将细胞胞破碎后后提纯出出全部信信使RNNA。这这些信使使中包含含了该细细胞内表表达的所所有蛋白白质的合合成信息息。4，利用基基因扩增增技术（PCR），找出所需的目的基因。5，将目的的基因连连接到设设计好的的质粒载载体，形形成了重重组DNNA分子子。6，将重组组后DNNA分子子引入到到受体细细胞内，然然后选择择合适的的培养条条件使细细胞繁殖殖。根据据选择性性标记，从从菌落中中筛选出出目的基基因的重重组(工程)菌。三、工程菌菌应具备备的条件件1，发酵产产品是高高浓度、高高转化率率和高产产率的，同同时是分分泌型菌菌株。2，菌株能能利用常常用的碳碳源，并并可进行行连续发发酵。3，菌株不不是致病病株，也也不产内内毒素。4，代谢控控制容易易进行。5，能进行行适当的的DNAA重组，并并且稳定定，重组组的DNNA不易易脱落。四、工程菌菌的应用用1，基因药药物例如，红细细胞生成成素、胰胰岛素、干干优素、乙乙肝疫苗苗、生长长激素和和粒细胞胞巨噬细细胞集落落刺激因因子等。2，其它发发酵产品品例如酶制剂剂、氨基基酸（苏苏氨酸、色色氨酸）、抗抗生素等等。第二节 工工程菌的的培养就生产流程程而言，从从发酵到到分离、纯纯化目标标产物，工工程菌和和常规微微生物并并无太多多的差异异。但工工程菌在在保存过过程中及及发酵生生产过程程中表现现出不稳稳定性，以以及安全全性等问问题，使使得工程程菌的培培养有着着自身所所特有的的特点。 一、安全问问题关于基因工工程的社社会问题题，必须须提到它它的潜在在危险性性。经过过重组的的菌和质质粒一旦旦用于，工工业化生生产，就就不可避避免地进进入自然然界。这这些菌能能间接地地危害人人体健康康，使治治疗药物物失去效效用，污污染环境境等。因因此，安安全问题题是极其其重要的的。 119744年，提提出了DDNA重重组实验验具有潜潜在生物物危险性性的问题题。后来来，美、日日等国都都制定了了有关DDNA重重组实验验的准则则，即在在试管内内用酶等等构建异异种DNNA的重重组分子子，并用用它转入入活细胞胞中的实实验，以以及使用用重组体体的实验验应遵循循的规程程。其目目的是保保证实验验的安全全和推动动重组DDNA的的研究。这这些准则则参照了了防止病病原微生生物污染染的措施施，以及及根据对对实验安安全度的的评定，采采用物理理密封(P1P4)和生物物学密封封(B11和B22)两种种方法。 物物理密封封是将重重组菌封封闭于设设备内，以以防止传传染给实实验人员员和向外外界扩散散。实验验规模在在20LL以下时时，物理理密封由由密封设设施、实实验室设设计和实实验注意意事项组组成。密密封程度度分为PP1、PP2、PP3和PP4级，数数字越大大，密封封水平越越高。生生物学密密封要求求用只有有在特殊殊培养条条件下才才能生存存的宿主主，同时时用不能能转移至至其它活活细胞的的载体，通通过这样样组合的的宿主载载体系统统，可以以防止重重组菌向向外扩散散。按密密封程度度分B11和B22级，BB2级的的密封要要求最严严格。 企企业中进进行重组组菌培养养时的设设备标准准有LSS-1和和LS-2。LLS-22相当严严格，工工业生产产起码应应在LSS-1的的设备标标准下培培养。LLS-11标准要要点是：(1)使用防防止重组组菌体外外漏，能能在密闭闭状态下下进行内内部灭菌菌的培养养装置；(2)培养装装置的排排气由除除菌器排排出；(3)使使用易产产气溶胶胶的设备备时，要要安装可可收集气气溶胶的的安全箱箱等。设设计用于于基因重重组菌的的培养装装置时，不不仅要考考虑外部部杂菌的的侵入，还还要防止止重组菌菌的外漏漏。此外外，培养养后的菌菌体分离离、破碎碎等处理理也必须须在安全全柜内进进行，或或是采用用密闭型型的设备备。二、基因工工程细胞胞培养特特点 前前已述及及，基因因工程细细胞培养养过程与与培养方方式与天天然细胞胞培养过过程或方方式基本本致。但但亦有其其自身持持点。实实践表明明，基因因工程细细胞工业业化培养养中，产产物的产产率往往往比实验验室培养养规模为为低。其其原因主主要与基基因工程程细胞特特点有关关，首先先基因工工程细胞胞的生长长速率及及表达率率与其所所载外源源DNAA的稳定定性及产产物分泌泌过程有有关，其其中重组组DNAA的稳定定性尤为为重要，重重组DNNA在宿宿主内表表达方式式有两种种，其一一是游离离表达方方式、其其二是结结合表达达方式。因因此，基基因工程程细胞培培养过程程，重组组DNAA的丢失失方式亦亦有两种种，其一一是细胞胞培养过过程，由由于回复复突变或或分配作作用致使使DNAA丢失称为脱脱落性不不稳定，其其二是重重组DNNA中编编码的结结构基因因在宿主主内发生生再重组组过程产产生突变变，不再再表达目目的产物物，此称称加结构构性不稳稳定。其其次为提提高基因因工程细细胞表达达效率，需需采取适适当措施施，提高高重组DDNA在在宿主细细胞内的的拷贝数数及促进进表达产产物自细细胞内向向细胞外外分泌。此此外，基基因工程程细胞的的原宿主主通常是是某些培培养物质质(如某某种氨基基酸或维维生素等等)的缺缺陷型，有有些基因因工程细细胞生产产过程亦亦产生某某些抑制制细胞生生长的代代谢物。由由此，在在培养工工程中应应考虑控控制培养养液营养养成分及及其浓度度，同时时采取措措施，消消除抑制制细胞生生长的代代谢物，以以保证细细胞正常常生长。由由此可见见，在基基因工程程细胞培培养过程程，除般培养养条件外外，必需需考虑基基因工程程细胞的的自身特特点，确确定最佳佳培养条条件。三、基因工工程细胞胞的培养养 前前已述及及，基因因工程细细胞的培培养过程程与一般般需氧细细胞培养养基本一一致，同同时培养养方式亦亦无差异异，可采采用各种种分批培培养方式式，亦可可采用连连续培养养、半连连续培养养及透析析培养等等方式。至至于影响响基因工工程细胞胞培养的的细胞生生物量得得率与产产物量的的因素及及有关参参数。亦亦可参照照普通细细胞相应应培养方方式求得得。 目目前关于于动植物物基因工工程细胞胞培养工工程的研研究刚刚刚起步，有有待进步发展展。这里里仅对基基因工程程菌的营营养控制制、质粒粒稳定性性、重组组质粒拷拷贝数的的控制及及表达效效率作简简单讨论论。1，底物浓浓度的控控制在基因工程程茵培养养过程，至至少要遵遵循PII级物理理防护的的规定，因因此必需需进行菌菌体的高高密度培培养。普普通Ecolli培养养时最高高干重菌菌体收率率可达11255，酿酿酒酵母母可得114.55%，浙浙枯草杆杆菌仅可可得2%左右。根根据这些些结果采采用枯草草杆菌不不太合适适，除非非其具有有产物的的高效分分泌系统统。 从从生物安安全性考考虑，培培养的基基因工程程菌通常常是维生生素或氨氨基酸的的营养缺缺陷型突突变株。培培养过程程细胞对对维生素素需求量量甚微，在在培养开开始即加加入必需需量对细细胞生长长并无影影响，但但培养一一开始即即加入足足够量氨氨基酸则则可能因因氨基酸酸浓度过过大而抑抑制细胞胞生长。在在此情况况下，可可采取培培养过程程中，在在调节ppH值同同时补加加氨基酸酸混合物物和葡萄萄糖的方方法，以以便培养养过程葡葡萄糖及及氨基酸酸浓度的的基本恒恒定，从从而实现现高密度度培养，如如Eccolii C6600株株培养时时可获得得6干干菌体。但但菌体对对葡萄糖糖及氨基基酸的收收率因培培养条件件而异，如如以葡萄萄糖及分分别用苏苏氨酸、亮亮氨酸、组组氨酸及及色氨酸酸为底物物时，则则平均每每克底物物所获干干菌体量量分别为为0.33、2.5、115、440及440g 。按每每克干菌菌体成本本计，应应用苏氨氨酸成本本最高，故故应避免免应用苏苏氨酸缺缺陷型菌菌株为宿宿主，最最好选用用维生素素缺陷型型菌株为为宿主。2、质粒稳稳定性重组质粒上上通常载载有Appr基因，获获得该类类重组质质粒的基基因工程程菌在含含氨苄青青霉素培培养液中中可以生生长，而而非基因因工程菌菌不能生生长。但但在基因因工程菌菌高密度度培养时时，外加加的抗生生素APP易于失失活，影影响培养养。为此此考虑采采用抗生生素依赖赖性变异异法替代代抗生素素添加法法。其方方法是通通过诱变变使宿主主成为某某抗生素素依赖性性突变株株(如链链霉素依依赖性SSmd)。只只有在SSm存在下下宿主才才能生长长，但重重组质粒粒上含有有Sm非依赖赖性(SSmidd)基因因，将重重组质粒粒导入宿宿主细胞胞后，所所获克隆隆菌可在在不含抗抗生素培培养基中中生长，而而丢失质质粒菌株株却不能能生长。此此法很有有实用价价值，但但缺点是是宿主细细胞易产产生回复复突变，造造成培养养工程复复杂化，产产物产率率下降。 为为考察质质粒稳定定性，在在此引入入质粒保保持率FFn的概念念，Fnn表示分分批培养养中细胞胞分裂nn次后，培培养液中中基因工工程细胞胞数与总总细胞数数的比值值，即假定在分批批培养过过程中，细细胞在对对数生长长期每次次分裂时时，其质质粒丢失失率为PP，则FFn为：式中 -质粒丢丢失菌株株与质粒粒保持率率菌株的比值值； n-细胞分分裂次数数理论上基因因工程菌菌载荷外外源性基基因，培培养过程程细胞大大量合成成外源性性产物，其其负荷大大于质粒粒丢失菌菌株，故故基因工工程菌株株比生长长速率通常较较质拉丢丢失菌株株小，当当然亦有有变化不不大者。根根据以上上方程计计算结果果，Fnn变化情情况如图图7-220所示示。由图7-220可知知假定定P11%，当当0时时，表明明质粒丢丢失菌株株不能生生长，培培养处于于最理想想的稳定定状态，亦亦为质粒粒最稳定定状态，此此时Fnn接近于于1.00；但在在无选择择压力下下，值越大大，Fnn越低，即即质粒稳稳定性越越差。 在在基因工工程细胞胞的连续续培养方方式中，若若无选择择压力，迪迪常不能能得到恒恒定的稳稳定状态态。而在在有选择择压力下下，则可可获得稳稳定状态态。但是是培养基基也与质质粒稳定定性有关关，采用用天然培培养基培培产时质质粒稳定定件较用用合成培培养基为为高，在在天然培培养基中中即使无无选择压压力亦可可保持质质粒的稳稳定性，因因此，用用天然培培养基进进行连续续培养是是获得质质粒稳定定性的良良好方法法。3，表达效效率及质质粒拷贝贝数控制制在基因工程程细胞培培养工程程中，表表达效率率与质粒粒拷贝数数有关。在在质粒稳稳定基础础上，应应尽可能能提高细细胞内质质粒拷贝贝数。在在工业生生产中易易于操作作的方法法是在培培养的不不同阶段段，采用用不同培培养温度度达到提提高拷贝贝数目的的，在前前培养阶阶段采用用低温，以以减少细细胞负荷荷，此时时拷贝数数较低，而而比生长长速率升升高，在在主培养养中途升升高温度度，质粒粒拷贝数数增加，目目的基因因产量提提高。如如图7-21所所示，在在25下，培培养含有有穿梭质质粒pCCP3的Eccolii C6600/pCII8577至浊度度为5。再再将培养养温度提提高至337，则质质粒拷贝贝数增加加，基因因产物-内酰酰胺酶活活性增加加37倍倍左右，但但Fn急剧下下降。此此外，利利用噬菌体体PL启动子子的温度度敏感性性，采用用二级连连续培养养方式，第第1罐于于低温下下培养以以降低表表达效率率，第22罐高温温培养，对对提高表表达效率率亦是有有效的。 此此外，当当质粒拷拷贝数与与某些化化合物有有关时，亦亦可采取取添加或或去除相相应化合合物的双双阶段连连续过滤滤培养法法以提高高拷贝数数和表达达效率。如如用含有有在色氨氨酸启动动子下游游接有-半乳乳糖苷酶酶基因的的重组质质粒pMMCT998的基基因工程程菌进行行单级连连续培养养，并结结合0.2m孔径径陶瓷过过滤器装装置(图图7-222)，开开始培养养液含色色氨酸，表表达效率率低，当当生长浊浊度达到到10时时，进行行交叉流流动过滤滤，且供供给不含含色氨酸酸料液，结结果如图图7-223所示示。过滤滤达155minn后培养养液中已已测不出出色氨酸酸，表达达效率增增加，-半乳乳糖苷酶酶活力剧剧增。最最终浊度度达1550(相相当于含含6%干干细胞)，半乳糖糖苷酶约约占总蛋蛋白量88%。 由由此可知知，在基基因工程程细胞培培养工程程中，需需根据其其固有特特点和具具体情况况，采取取相应措措施、提提高质粒粒稳定性性，增加加质粒拷拷贝数，实实现培养养条件优优化，提提高表达达效率。第三节工程程菌分批批培养动动力学对于质粒脱脱落性不不稳定，细细胞在分分裂时丢丢失质粒粒的概率率为p，则所以对于底物对于产物第四节 培养装装置与产产物的提提取工程菌的培培养与普普通微生生物的培培养方法法类似。在在进行以以工业化化为目的的的DNNA重组组实验，以以及为生生产异种种基因产产物而培培养重组组菌时，当当然应采采用简便便易行的的培养系系统。现现在多半半使用大大肠杆菌菌为宿主主，而在在一般的的通气搅搅拌罐中中大肠杆杆菌能生生长良好好。 一、培养装装置 作作为基因因重组体体的培养养装置，与与一直沿沿用的通通气搅拌拌培养罐罐要有区区别，即即不仅要要防止外外部微生生物侵入入罐内，还还必须采采用不使使培养物物外漏的的培养装装置。按按实验准准则，可可把这类类密闭型型通气搅搅拌式培培养罐划划分为操操作液量量20LL以上和和20LL以下两两种。 现现今使用用的微生生物培养养装置，按按其灭菌菌法又可可分两类类。一是是在高压压灭菌器器中进行行培养基基及培养养罐的灭灭菌，罐罐本身通通常是玻玻璃制的的，容量量在100L以下下的居多多；另一一类是220L以以上的培培养罐，一一般为不不锈钢制制品，多多采用通通新鲜蒸蒸气进行行灭菌。前前者是可可移动的的台式，罐罐本身不不能承受受高压；后者，蒸蒸汽、空空气等供供给是用用固定管管道连接接的，一一般不能能移动；这两类类罐要充充分考虑虑不使微微生物由由罐外进进入罐内内的问题题，但并并不一定定要解决决防止罐罐内微生生物的外外漏问题题。 因此，采采用高压压灭菌器器灭菌的的小型培培养罐时时应在安安全柜内内运转。但但培养罐罐稍大，该该法就难难以使用用了。二、基因重重组菌外外漏的防防范 首首先应了了解培养养微生物物在普通通通气搅搅拌罐中中可能发发生外漏漏的部位位和操作作。归纳纳起来有有：(11)排气气，(22)机械械密封，(3)接接种，(4)取取样，(5)培培养后的的灭菌(通入湿湿热蒸气气)，(6) 排液(输至下下一工序序)。针针对这些些均应采采取一些些措施以以防菌体体外漏。现现分别说说明如下下。 11，排气气 排排出的气气中含有有大量气气溶胶，在在激烈起起泡的培培养时，培培养液呈呈泡沫状状。它们们从排气气口向外外排出，重重组菌也也容易随随之外漏漏。 以以往培养养病原菌菌时；为为防止菌菌体外流流，采取取加药剂剂槽的方方法，但但效果如如何尚有有疑问。有有人试验验证明，排排气中的的微生物物数量随随着培养养液中菌菌体浓度度和通风风速度等等而变化化。用55L培养养罐(装装液量22.5LL)，以以搅拌速速度4000r/minn，通气气速度11：1(VVMM)，即即2.55L/mmin(换算成成罐内通通气速度度为111cm/minn)来培培养大肠肠杆菌，发发现每毫毫升培养养液中含含1099个菌体体，每小小时有11504000个菌随随气排出出；而培培养酿酒酒酵母时时，每小小时从每每毫升含含1088个菌体体培养液液的排气气中检出出3070个个。由此此可见，虽虽然培养养液中菌菌体浓度度相差很很大，但但大肠杆杆菌和酵酵母菌仍仍以几乎乎相同程程度从排排气中漏漏出，并并不取决决于菌体体个体的的大小。再再有，提提高通气气速度时时，单位位体积的的排气中中，大肠肠杆菌和和酵母菌菌菌数都都增加，通通气速度度与漏菌菌数之间间也密切切相关。总总之，排排气过程程中含有有相当多多的菌。为为此，在在通用通通气搅拌拌型培养养罐上安安装排气气鼓泡器器，以防防止激烈烈起泡时时泡沫直直接外溢溢和外部部微生物物侵入污污染，同同时还能能肉眼观观察通气气状态等等(图111-88)。气气体通过过排气管管到鼓泡泡瓶，再再通过膜膜滤器。进进而考察察了该排排气鼓泡泡瓶中加加入药剂剂(如22moll/L NaOOH)的的效果。 另另外，为为了解加加热能否否对排气气灭菌，进进行了与与上述类类似的实实验。图图11-9的结结果表明明。用电电热器对对排气进进行加热热时，在在电热器器出口处处的排气气温度被被控制在在2000°C左右右。电热热器之后后附有冷冷凝器，旨旨在使高高温的排排气冷却却，以防防膜滤器器烧毁。 图图11-8和图图11-9的结结果如表表11-4所示示。表中中数字为为培养开开始启112h中中在膜滤滤器上捕捕集到的的活菌数数。结果果表明，排排气仅通通过药剂剂还不能能完全灭灭菌。使使用药剂剂时若能能在排气气鼓泡瓶瓶内进行行搅拌、消消泡的话话，是会会有效果果的。用用电热器器将排气气加热至至2000°C 时时，均末末在膜滤滤器上检检出大肠肠杆菌和和酵母菌菌。 图图11-10是是基因重重组菌培培养装置置中普遍遍采用的的排气除除菌系统统。为减减少培养养液的蒸蒸发量和和降低排排气的相相对湿度度。在罐罐排气口口外安装装冷却冷冷凝器，其其后才是是加热器器，排气气气体经经此加热热至600800°C。相相对湿度度降低可可预防滤滤器上凝凝结水汽汽。除菌菌滤器与与培养罐罐空气入入口处的的相同。排气中的微微生物（个个）菌种鼓泡瓶碱电热器大肠杆菌酿酒酵母980716114000除菌滤器有有经多孔孔填料除除菌的膜膜型滤器器和深度度型滤器器。后者者主要用用于气体体过滤，其其原理与与膜滤器器不同，无无筛网的的效果，而而是通过过静电吸吸附、惯惯性冲撞撞等作用用捕集气气体中的的粒子。无无论使用用哪种类类型的滤滤器，都都应对排排气进行行去湿处处理。使使用膜滤滤器时，因因滤器表表面凝结结水汽，压压力损失失骤增，深深度型滤滤器除菌菌效率也也会因水水汽凝结结而下降降。膜滤滤器原来来多用于于过滤液液体，通通过流水水性滤器器的开发发，也能能应用于于气体过过滤了。 22，机械械密封 通通气搅拌拌培养罐罐中贯穿穿罐的搅搅拌轴须须与传动动部连接接。作为为这部分分的轴封封使用的的是机械械密封，有有单机械械密封和和双机械械密封之之分。前前者由单单密封面面将罐与与外界隔隔开。此此密封部部分因高高速旋转转产生摩摩擦热，故故需冷却却和润滑滑。这样样一来，即即便正常常运转，培培养液也也会一点点一点地地渗入密密封面，很很有可能能经此流流出。同同时，灭灭菌时的的热膨胀胀差也会会使流出出量增加加。这是是培养结结束后灭灭菌时最最易外漏漏的所在在。还有有，机械械密封受受使用寿寿命所限限，在溢溢漏发生生前就应应定期更更换。所所以单机机械密封封的培养养罐不宜宜用于基基因重组组菌的培培养。 双双机械密密封是用用高于罐罐内压的的压力，将将贮存于于另一润润滑液槽槽中的无无菌水压压入机械械密封部部，用作作轴封润润滑液。这这时，上上、下两两部分即即使有一一部分的的密封液液渗漏，培培养液也也几乎无无外漏危危险。但但上、下下两方同同时溢漏漏时，培培养液亦亦有可能能外漏了了。因此此，问题题在于搅搅拌轴是是由罐的的上部还还是下部部通入。从从培养装装置的使使用优点点及搅拌拌轴长度度等角度度看，用用下搅拌拌为好。但但若考虑虑培养液液外漏的的情况，培培养基因因重组菌菌时，以以用上部部搅拌的的双机械械密封为为好。 用用磁力方方法改变变搅拌动动力的传传动就不不必担心心机械密密封的外外漏了。110L以以下的培培养装置置以往一一直是用用磁力进进行动力力传动的的，但罐罐一大，会会出现磁磁力不足足、轴承承磨损等等问题。目目前大至至90LL培养罐罐，已能能用强磁磁力进行行动力传传动。现现时，基基因重组组菌的培培养罐仍仍采用双双机械密密封的上上搅拌方方式为多多，其次次用双机机械密封封的下搅搅拌方式式。 33，取样样 普普通培养养罐的取取样管道道在取样样时会流流出样品品。取样样后对样样品管道道灭菌时时，未灭灭菌的培培养液污污水被排排至排水水管内。对对此，必必须采取取措施，如如用取样样工具进进行取样样(图111-111)。此此法可在在培养液液不接触触外界的的条件下下取样。用用高压灭灭菌器使使其灭菌菌或是连连接后用用蒸汽灭灭菌，灭灭菌结束束后将样样品从罐罐中取出出送入样样品管中中。取完完所需的的样品，卸卸下之前前对取样样管道再再次灭菌菌。卸下下经灭菌菌的连结结器，在在安全柜柜中卸下下样品管管。取样样中使用用的排水水管管道道与废液液灭菌贮贮罐相连连，取样样及灭菌菌时产生生的排水水一并贮贮存于罐罐内，经经灭菌后后排出。此此外还设设计了各各种安全全取样用用的器具具。例如如，通过过双层橡橡皮膜，用用注射器器取样；把可移移动的完完全密封封型的球球形箱与与取样管管连接，在在此箱中中取样等等。但是这些操操作都由由人工控控制，操操作中难难免出错错。为了了减少操操作人员员接近工工程菌的的机会，尽尽量不用用人工操操作而采采用自动动取样装装置最为为安全。图图11-12为为自动取取样装置置的流程程图。取取样方法法与人工工取样程程序大致致相同。同同时，取取样过程程因采用用程序系系统控制制而易于于变动。取取出的样样品保存存于冷库库内，冷冷库内的的空气经经滤器过过滤，内内部也可可进行灭灭菌。4，培养后后的灭菌菌培养后对培培养液和和管道等等进行灭灭菌时，一一开始流流出的末末灭菌排排水有可可能存在在活的重重组菌。取取样、排排液的管管道中能能产生这这类排水水，因此此，一定定要另行行安装排排水管并并与废液液灭菌贮贮槽等相相连接，以以便徘放放污水。5，接种向罐内直接接接种的的方法是是不安全全的。简简单的安安全接种种法是将将种子瓶瓶与培养养罐以管管相连接接后，用用无菌空空气加压压压入的的方法。另另一种方方法是先先把种子子液在安安全柜内内移至供供接种用用的小罐罐内，再再将其与与培养罐罐连接，用用蒸汽对对连接部部分灭菌菌后，把把种子罐罐中的种种子液接接入培养养罐内。6，排液培养后要将将培养液液输送至至贮罐等等下一道道工序，这这时也有有可能产产生气溶溶胶和重重组菌的的扩散。安安全的方方法是在在培养开开始前就就将排液液口与下下段工序序相连接接并进行行灭菌，这这样培养养于结束束即可直直接输送送培养液液。如果果排液口口未与下下段工序序相连那那就应与与连结废废液灭菌菌罐的排排水管道道相接，这这样就安安全了。三、培养罐罐的管道道布局图11-113表示示重组菌菌培养罐罐(P22、P33级)的的整体流流程图。重重组菌培培养罐中中，凡有有可能外外漏重组组菌的部部分都与与排污管管道相连连。图中中所示的的管路能能分离并并排出污污染重组组菌的污污水。 可可是实际际操作者者必须小小心谨慎慎，否则则难以防防止因疏疏忽而造造成的重重组菌的的扩散。为为减少操操作误差差和实验验者接近近重组菌菌的机会会，应安安装连锁锁装置，实实现自动动化操作作，人可可在别的的室内进进行监视视。此外外，必须须设置警警报系统统监测培培养罐压压力，以以免发生生异常。 另另外，培培养后的的后处理理工序中中也必须须采取防防污措施施。例如如，菌体体的分离离通常使使用沙氏氏(Shharppress)型离离心机；由于很很可能产产生气溶溶胶，故故用膜分分离法进进行浓缩缩。 采采取上述述措施基基本上就就能避免免培养罐罐中的基基因重组组菌外漏漏了。估估计能达达到大量量培养重重组菌实实验准则则中LSS1、LLS-22等物理理性密封封试验的的标准。四、基因工工程产品品的提取取和精制制传统的发酵酵产品和和基因工工程产品品在提取取和精制制上的不不同，主主要表现现在下列列两方面面：(11)传统统发酵产产品多为为小分子子(工业业用酶除除外，但但它们对对纯度要要求不高高，提取取方法较较简单)，其理理化性能能，如平平衡关系系等数据据都已知知，因此此放大比比较有根根据；相相反，基基因工程程产品都都是大分分子，必必要数据据缺乏，放放大多凭凭经验。(2)基基因工程程产品大大多处于于细胞内内，提取取前需将将细胞破破碎，增增添了很很多困难难。由于于第一代代基因工工程产品品都以大大肠杆菌菌作宿主主，无生生物传送送系统，故故产品处处于胞内内。而且且发酵液液中产物物浓度也也较稀，杂杂质又多多，加上上一般大大分子较较小分子子不稳定定(如对对剪切力力)，故故提取较较困难，常常需利用用高分辨辨力的精精制方法法，如色色层分离离等。在在其它方方面，基基因工程程产品的的提取方方法与传传统发酵酵产品相相似，详详见下篇篇(下游游加工过过程)。目前认为，基基因工程程产品的的回收率率达到330、440就就已相当当不错。因因此，尽尽量减少少提取步步骤是相相当重要要的。 另外，对于于基因工工程产品品，还应应注意生生物安全全(biiosaafetty)问问题，即即要防止止菌体扩扩散，特特别对前前面几步步操作，一一般要求求在密封封的环境境下操作作。例如如用密封封操作的的离心机机进行菌菌体分离离时，整整个机器器处在密密闭状态态，在排排气口装装有一无无菌过滤滤器，同同时有一一根空气气回路以以帮助平平衡在排排放固体体时系统统的压力力，无菌菌过滤器器用来排排放过量量的气体体和空气气，但不不会使微微生物排排放到系系统外。