基因工程重组人干扰素11259.docx

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素： IFN、IFN、IFN 、IFN 来源：白细胞、成成纤维细胞胞、病毒感感染的组织织细胞等 功能 ：抗病毒毒感染、抗抗肿瘤生长长 免免疫调节(较弱）其其中IFNN-为多基因因产物，有有23种以以上的亚型型。 III 型干干扰素：干干扰素（IFNNg) 来源源：活化的的T细胞和和NK细胞胞产生 功能能：免疫调调节Ø 提提高单核巨巨噬细胞、树树突状细胞胞的抗原提提呈能力Ø 增增强Tc细细胞和NKK细胞的杀杀伤活性Ø 抑抑制TH22细胞形成成，下调体体液免疫应应答Ø 趋趋化作用Ø 抗抗病毒和抗抗肿瘤作用用（次要）2. 根据据动物来源源确定分类类，例如人人干扰素（HHuIFNN），小鼠鼠干扰素（MMuIFNN）。免疫调节作作用表现在在对宿主免免疫细胞活活性的影响响，如对巨巨噬细胞、TT细胞、BB细胞和NNK细胞等等均有一定定作用。l 对巨噬细胞胞的作用：IFN可使巨噬噬细胞表面面MHC类分子的的表达增加加，增强其其抗原递呈呈能力；此此外还能增增强巨噬细细胞表面表表达Fc受受体，促进进巨噬细胞胞吞噬免疫疫复合物、抗抗体包被的的病原体和和肿瘤细胞胞。l 对淋巴细胞胞的作用：干扰素对对淋巴细胞胞的作用较较为复杂，可可受剂量和和时间等因因素的影响响而产生不不同的效应应。在抗原原致敏之前前使用大剂剂量干扰素素或将干扰扰素与抗原原同时投入入会产生明明显的免疫疫抑制作用用；而低剂剂量干扰素素或在抗原原致敏之后后加入干扰扰素则能产产生免疫增增强的效果果。在适宜宜的条件下下，IFNN对B细胞胞和CD88+T细胞胞的分化有有促进作用用，但不能能促进其增增殖。IFFN能增强TTH1细胞胞的活性，增增强细胞免免疫功能；但对THH2细胞的的增殖有抑抑制作用，因因此抑制体体液免疫功功能。IFFN不仅抑制制TH2细细胞产生IIL-4，而而且抑制IIL-4对对B细胞的的作用，特特别是抑制制B细胞生生成IgEE。l 对其它细胞胞的作用：IFN对其他细细胞也有广广泛影响：刺激中性性粒细胞，增增强其吞噬噬能力；活化NKK细胞，增增强其细胞胞毒作用；使某些正正常不表达达MHC类分子的的细胞（如如血管内皮皮细胞、某某些上皮细细胞和结缔缔组织细胞胞）表达MMHC类分子，发发挥抗原递递呈作用；使静脉内内皮细胞对对中性粒细细胞的粘附附能力更强强，且可分分化为高内内皮静脉，吸吸引循环的的淋巴细胞胞。二 重组干干扰素的临临床应用l 广谱抗病毒毒活性（rrhuIFFN） 慢性性乙型、丙丙型、丁型型肝炎；疱疱疹、病毒毒性角膜炎炎。l 直接抗肿瘤瘤活性（rrhuIFFN） 毛细胞胞和慢性髓髓样白血病病、 Kaaposii肉瘤、非非霍奇金淋淋巴瘤。l 免疫调节活活性治疗慢慢性肉芽肿肿瘤（rhhuIFNN）l 多发性硬化化症 rhhuIFNN对已知基因因序列的干干扰素 , 基因文文库的调用用可以用其其序列 33' 端和和 5' 端部分事事先用同位位素标记过过的序列作作为探针 , 通过过杂交的方方法进行调调用。由于于干扰素基基因的种属属特异性不不是很大 ,| 可可以用人的的干扰素基基因为同源源探针 , 从鼠基基因文库中中调出相应应的干扰素素基因 , 其方法法将在下文文 1 中中提到。 |对于扰扰素基因的的取用 , 不仅可可以使用构构建基因文文库的方法法 , 对对已了解其其氨基酸或或核昔酸割割成的干扰扰素也可以以用化学合合成的方法法先合成其其编码的 DNA 序列 , 再对其其进行表达达。化学合合 | 成成方法包括括固相合成成法及液相相合成法两两大类。与与利用基因因文库的方方法相比 , 化学学合成法比比较 | 复杂 , 由于每每加入一个个核昔酸就就会有一定定比例的错错误掺入、基基因重叠、基基因缺失等等情况 , 并且在在 l 整整个合成过过程中这种种错误不断断积累 , 因此该该方法适合合比较短的的基因 , 而对长长的基因则则有目的产产 | 物物含量低、产产物纯化困困难的缺点点。但它也也有优点 , 如可可根据研究究的需要对对一些氨基基酸进行定定点 | 突变 , 或根据据宿主菌的的特性 , 在不改改变其氨基基酸组成的的情况下使使用宿主的的偏爱密码码子 , 以提高 | 产物物的产量。 |对于不不同亚型的的干扰素 , 由于于同源性较较高 , 可以用相相同的引物物从诱导的的小鼠细胞胞系中提取取mRNAA 混合物物进行反转转录和扩增增 , 然然后用亚型型特异性探探针对 CCDNA 混合物进进行 Sooutheern 印印迹 , 这样便可可将序列上上相差较小小的同种、不不同亚型的的干扰素基基因进行分分离 , 为生产高高纯度的单单一干扰素素提供了方方法 O三三、表达方方法随着对对干扰素研研究的深入入 , 人人们了解到到鼠干扰素素的抗病毒毒活性主要要位于氨基基酸序列上上的1040 位位、 7881077 位、 123166 位的 AA 、 BB 、 CC 区 , 尤其是是位于 778 和 79 位位的氨基酸酸对抗病毒毒 | 活活性十分重重要。而人人 IFNNt1 的的 12111366 位对抗抗病毒活性性作用较大大 , 人人 IFNN 子的 N 端 10 个个集 | 基酸也是是保持其活活性所必需需的。对干干扰素结构构的了解为为更好地构构建基因表表达奠定了了基础。干干 | 扰扰素最初是是用其外源源序列进行行表达的 , 但近近年来的研研究表明嵌嵌合表达的的干扰素往往往优于单单一干扰素素 , 因因此出现了了较多的嵌嵌合表达形形式 , 并取得了了较好的效效果。1.IFN- 的表表达家蚕作作为一种用用于表达外外源基因的的宿主有易易于养殖、生生产周期短短、夕阳基基因表达量量高的优点点 , 同同时由于家家蚕为真核核生物 , 能对表表达产物自自行进行糖糖基化修饰饰 , 产产生有生物物活性的蛋蛋白 , 并且在产产物提取的的过程中只只要将家蚕蚕进行匀浆浆 , 再再进行抽提提即可 , 操作上上十分方便便 , 因因此 , 它在基因因工程领域域内被广泛泛应用。下下面便以人人 IFNN, 的的生产为例例介绍家蚕蚕表达体系系在干扰素素生产中的的应用。用用家蚕核型型多角病毒毒 BIIIINPVV 体外感感染的家蚕蚕传代细胞胞株 BMM-N 通通过噬菌斑斑法纯化得得到 BmmNPV 的 33 亚型。利利用从感染染脂肪体 mRNAA 制得的的 CDNNA 为探探针 , 对其多角角蛋白序列列进行检验验 , 其其中 100.5kbb 的 EEcoR I 片段段及 3.9 灿的的 HinndE 片片段可与探探针杂交 , 将 10.55 灿的 EcoRR I 片片段克隆到到 pBRR322 中 , 产生质粒粒 pBmmE3600 对其用用 HinndE 切切 , 得得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有有多角蛋白白全部序列列 ( 图图 1233 中为黑黑色框架 ), 将将该片段插插入 pUUC9 的的 HinndE 位位点 , 产生质 | 粒 p9H118 。将将 p9HH18 用用 EcooR I 切后于 50U BAL331 外切切核酸酶缓缓冲液中 23 水浴 110minn, 更 | 掐锺锺油油菲如如 n 入入 07 倍他烈的的。气 mmnlAdd EDTTA 终止止反应。将将截短的 p9H118 片段段用 Hiind EE i切 , 并通通过琼脂糖糖凝胶电泳泳分离 22.7kbb 的 HHind 皿平头末末端片段 , 将其其插入 ppUC9 即 p99B3100的 Hiind HHI-Smma I 位点 OO 另外 , 将 pBmEE36 的的 3.11 峙的 HinddE 片段段连接到 pUC88 上 , 得到质质粒 p88H2255, 用 EcoRR I 及及 Aatt E 切切 , 得得含有多角角蛋白基因因下游 33.1kbb 基因的的 3.55kb 片片段 , 将其连接接到 p99H18 的 4.7kb 的 EccoR IIAat E 片段段上 , 产生杂交交质粒 pp89B3310, 它在启动动子下游含含有多聚接接头 (EEcoR I 、 BamHH ISmma I 、 Saal I 、 Psst I 位点 ) 。将从从基因文库库中用 1183bpp 探针调调出的在 ATG 后含有 Sma I 位点点 ( 即即有序列 CCCGGGGATTG) 的的 IFNNm J 基因因片段连接接到 p889B3110 上 , 便构构建成质粒粒 pIFFN2B3310 。将将 pIFFN2B3310 与与病毒基因因组 DNNA 便可可共转染 BM- N 细胞胞系或家蚕蚕幼体 , 其具体体操作如下下 : 向向 2.55mL 含含有 0.25moolACaaCl2 、 100 gg BmNNPV DDNA 及及 65 g pIFNN2B3110 的溶溶液中加含含 0.228II11014NNaCl 、 0.7mmooi/L Na2CC03 、 0.7IIIIIII10144 Na22HP044 、 550mmool/L EfEPPE (ppH 7.1) 的的缓冲液 , 进行行沉淀。取取 0.445ml 沉淀加至至 4.55mi 含含 3 ×× 1066 个细胞胞的培养液液中 ,112h 后后换液一次次 , 再再培养 44d, 即即可得到重重组病毒 BmIFFN2B3310 。用用两个噬菌菌斑单位的的病毒感染染 3 ×× 1066 个 BBM-N 细胞或用用 50 L33 × 1105 个个噬菌斑单单位的病毒毒溶液注人人家蚕幼体体 , 培培养 244h 后收收集培养液液便可得到到干扰素。2.IFN- 目的表达将人 IFN-R 基因 HimdE 片段插人载体 pSV2-dhfr 中 SV40 晚期启动子 PL 下游的 Pvu E 位点。用此重组质粒与带有黄瞟岭磷酸核糖转移酶 (XGPRT) 基因的质粒 pSU-gpt 共转染次黄瞟岭磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 基因缺陷小鼠的骨髓瘤 (sp24) 细胞 O 经过霉盼酸及氨基喋岭培养基筛选 , 便可得到表达人 IFN-R 。具体操作步骤如下 : 将含有人 IFN-p 基因的重组质粒 pBV-92 用 EcoR I 及 Hind E 酶切 , 分别作为探针模板及插入片段 , 同时用 PvuII 切载体 pSVZdhfr 质粒 , 使其线性化后将外源基因插入。将次黄瞟岭磷酸核糖转移酶基因缺陷的 sp2/0 细胞在含有 10% 小牛血清、 10% 青链霉素的 DLfEM 培养基中传 34 代后在小空斑瓶中培养 24h, 成半悬浮状 ,400r/ 勺 1in 离心 5min 将细胞沉积加入新鲜培养基 , 再培养 24h 。转染液中含目的基因 pSVHIF 和标记基因 pSVZgpt( 比值为 10:1), 其中 DNA 浓度为 20 g/IIIlo 在 2IIIol/L CaCl263 阵、 10mmolATris-HCl (pH 7.1)428 L 中缓缓加入 2 × HeBs 液 (EEPES50mmol 只 L 、 NaCl280mmolA 、 Na2HP040.75mmolA 、 0.75IIlII1014 Na2HP04,pH 7.1) 约 500 L, 加入 sp2/0 细胞培养物中 , 轻轻摇匀 37 孵育 8h 。再更换为含有黄瞟岭 250 g/mL 、次黄瞟岭 15 g/mL 、胸昔 10 g/mL 、氨基蝶岭。 -2 g/mL 、霉盼酸 25 问 /mL 的 DhEM 培养基 ,37 cq 孵箱中选择性培养。一周后更换为含 250 g/mL 黄瞟岭的 D; 旧 M 培养基 , 继续培养 2 周以上 , 检查 IFN-P 活性。3.IFN- 的表达以鼠干扰素 MuIFN- 为例 ( 图 12-3) 。用含人 IFN- 编码区基因的探针与噬菌体 MG9 构建的鼠 M600 基因组 DNA 文库在 20% 甲酷胶中进行低严格性的杂交 , 膜用 0.3molANaCl 、 0.03II1014 拧棱酸纳及 0.1%NaEbS04 在室温洗涤两次。将结合的噬菌体用噬菌斑法纯化 , 提取 DNA 后 , 用多种限制性内切酶切 , 以 1% 葡聚糖凝胶电泳纯化后与人 CDNA 探针杂交 , 将 MG9 中与探针可以杂交的 10.5kb 的 BamH I 片段亚克隆到 pBR322 的 BaIIIH I 位点 , 产生质粒 pMG10.5 。通过电泳分出插入片段大于 6000 坤 , 即含有完整 MuIFN-Y 的质粒 , 用 PvuII 酶切 , 六个切点中有一个位于 5' 端非编码区 , 取从此切点到第一内元中 Cla I 的 348bp 的片段以及用 Cla I 及 Bgl H 酶切得的 MuIFNm 3F 端片段 O 将载体质粒 p342E 用 EcoR I 及 BamH I 酶切 , 并用聚合酶 I 将 EcoR I 切点补成平头末端 , 与以上制得的两个片段混合 , 一同转化大肠杆菌 294, 选出 AIIIP 抗性菌株 , 从中提取质粒即为含有干扰素编码基因的 pSVEII111 。用表面活性剂右旋糖所活化 COEL1 细胞 , 将质粒转入并培养 48h 后离心 , 上清液中便含有干扰素。4. 嵌合干扰素的表达嵌合干扰素大致可以分为两种类型 : 一种是两种不同类型或同类型而不同亚型的干扰素间进行嵌合 , 另一种是干扰素或其部分序列与其他活性物质 , 如抗体、白介素等进行嵌合 , 以便得到新的生物活性产物。下面就这两种情况分别举例介绍。将从基因文库中调出的编码淋巴细胞干扰素 B 和 D 的 CDNA 连接到大肠杆菌色氨酸启动子、操纵子、核糖体结合位点及起始密码子 ATG 后面 , 分别构成表达载体 pLYEN-B 和 PLy- IFN-D 。为构建嵌合干扰素 , 可先将亲代干扰素的编码序列在相同位点 S1(Sa113A I ) 、 Pv(PVUE) 、 S2(Sa113A I ) 切断 , 产生含有氨基端 160 、 192 、 6192 、 93150 、 93166 、 151166 位氨基酸的片段 , 用 6% 的聚丙烯酿胶凝胶电泳分离 ( 图 124) 。将合适的片段连接 , 得到嵌合DNA, 将含有嵌合 DNA 的质粒用 HindE 和 Pst I 切后将酶切片段连接到 pBR322 的 HindEm pst I 位点上 , 将得到的表达载体转入大肠杆菌中 , 同时对 DNA 序列进行测定。含有转入质粒的大肠杆菌 HT-2 在 M9 培养基中培养到 OD650 为 58 时 , 离心得到细胞 , 并用含 100mmoIATris-HC1 、 0.5molANaCl 、 5mmolAEDTA 及 0.1IIIEnol/L PMSF 的 pH 为 8.0 的缓冲液重新溶解之。在 0 加入 1mg/ml 溶菌酶 , 细胞在溶菌液中裂解。离心后将上清用单克隆抗体亲和层析柱纯化两次 , 将纯化后的活性干扰素溶于 PBS 后利用超滤膜 YM10 浓缩至 13 时 , 再将浓度调整到 0.1/IIIgmlo 利用 SDS 聚丙烯酷胶电泳对于扰素的纯度进行测定。IFN- 及 TTNF-RR 基因已已经分别被被克隆 , 并用工工程菌加以以表达。对对其序列的的研究表明明 , IIFN-RR 在竣基基端的 113 个氨氨基酸以及及 TNFF- 下在在氨基端的的 23 个氨基酸酸均对它们们的生物活活性没有影影响 , 因此在设设计构建 IFN- 与 TNERR 嵌合物物时可以将将其去除 , 利用用色氨酸启启动子构建建的含有 IFNEE 氨基基端 1334 个氨氨基酸及 TNF-P 竣基基端 1448 个氨氨基酸的表表达质粒结结构见图 12-550此外 , 基因因工程在抗抗体技术上上的应用使使干扰素与与抗体能够够有机地结结合 , 通过抗体体的靶向作作用 , 增强干扰扰素的定向向能力 , 提高干干扰素体内内作用的效效率。5. 提高干干扰素产量量的方法干干扰素是一一种诱生物物质 , 必须在一一定的诱生生剂如病毒毒、细菌等等作用不才才能生成 , 所以以在基因工工程中 , 常常用用一些强启启动子如色色氨酸启动动子 , 将干扰素素的表达从从条件型变变为组成型型 , 以以提高产量量。酵母是是一种较为为常用的表表达宿主 , 但其其外源基因因的大量表表达必须在在缺少元机机磷的条件件下才能进进行。通过过对其酸性性磷酸酶酶酶的阻遏基基因及温度度敏感型负负调控基因因进行改造造 , 就就可以使酵酵母菌在 35 的高温下下生长 , 在 225 下下诱导表达达 , 并并且其表达达与无机磷磷的含量无无关。实验验表明未诱诱导时产量量为 6 × 1004UA, 而诱导导后产量可可达到 11 × 1107UAA 。由于于 IFNN- 、自自、性质质各异 , 在进行行表达时 ,IFNN 干的产产量往往远远不及 IIFN- 、 IIFN- 日 , 因此就必必须进行表表达体系的的改进。如如利用含噬噬菌体 TT5 早期期启动子及及强核糖体体结合位点点的高效转转录二表达达体系 , 可以使使 IFNN- 的的表达也达达到 4 × 1009U/LL 的水平平。其方法法为用人工工合成的 T5P225 强启启动手 其中含含有启动于于及核糖体体结合位点点 ): 取代质粒粒 pJPP1 在 EcoRRV 与 HinddE 之间间的 Teef 启动动子 , 形成质粒粒 pJRR1R3, 将其用用 HinndE 线线性化后插插入 IFFNEY 的编码序序列 , 便可以得得到高效的的表达质粒粒 IFNN -IFNYY 。将 IFN 基因置于于 Tettr 基因因的上游 , 有利利于转化质质粒的筛选选和保持 ( 图 12-66)O其中中合成的启启动区序列列为 :EER II35 区区-10 区GAAAITCAAAAAAATrrAA TTTGCTTT AGGAAAAAAATTTTTI IIGTATTAATEE 丑 nnd 皿AAGAI AATAAAATTTGGAAGCCTAGGGAGGTTTTAAAGCTTT启动子核核糖体结合合位点四、提取、纯纯化及鉴定定对干扰素素的提纯可可分为粗提提和进一步步纯化 , 以 IIFN- 为例 , 粗提提时将菌液液 50000r/mmin 离离心取细胞胞 , 加加入 1/100 体积的 7moll/L 盐盐酸肌冰浴浴 2h 裂解细胞胞后 177000rr/minn 离心 5minn, 取上上清液。用用 5110 倍体体积的 00.15mmol/LL 棚酸盐盐缓冲液稀稀释后在 1OIIIIII11014 的 NHH4Ci 中透析 20h, 再 1150000r/miin 离心心 10rrIlinno 将上上清液用 80%(NH4)2S044沉淀 , 用水溶溶解后再透透析去除 (NH44)2S004, 再再用离子交交换的方式式分离各种种蛋白 OO 如果要要进一步纯纯化 , 可用单克克隆抗体进进行亲和层层析。将 Sephharosse4B 与纯化的的抗 IFFN- 单克隆抗抗体混合振振摇 , 室温放置置 4h 后低速离离心 , 并用 00.1Ennol/LL= N 注 fCC03(ppH8.55) 的缓缓冲液洗去去未结合的的抗体 , 加入等等体、积的的乙醇胶并并振荡 44h 以上上 , 将将残存的活活性基团加加以封闭 O : 用 pHH 4.00 的醋酸酸盐缓冲液液及 pHH 8.00 的 TTris-HCl 缓冲液交交 i替洗洗涤 3 次 , 并用 ppH 7.5 的 0.1mmolATTriSEEHCi 加以平衡衡 1 后后装柱。用用 pH 7.2 的 0.01moolJL PBS 洗柱至洗洗脱液 OIh880 到基基线 , 将含有 IFN 的混合液液上样 , 如一次次吸附不完完 A 全全可用流出出液再上柱柱一次。用用 PBSS 反复洗洗柱 , 至流出液液的 1 吸收回到到基线。用用 pH 2.5 的 0.1mollA Glly-HCCl 洗脱脱并分 44 段收集集 , 并并对各部分分浓度进行行测定。最最后用 ppH 2.5 的 0.1mmolA Gly-HCl 再生 , 用含 0.011% 间的的 PBSS 冲洗净净 ,4 保存。同同时 , 利用亲和和层析技术术还可以对对只占总蛋蛋白 0.1%11% 的干干扰素进行行分离和浓浓缩。五、活活性检测11. 对 (3 二二 5')oliggo(A) 合成酶酶活性的诱诱导在含 1% 小小牛血清的的 RPMMI16440 培养养基中培养养 2 ×× 1055 个 /ml DDaudii 细胞 , 并分分别加入 1U/mm1 、 10U/ml 、 100UU/ml 、 10000U/ml IIFN 。 24h 后 90000r/ minn 离心 2minn, 并将将沉淀分散散于 5000 L 冷的的含 200mmoiiAEfEEP- EES 、 5mmool/L MgCll2 、 I20mmmol 只 L KCl 、 7mmm0144 二硫苏苏糖醇、 10% 甘氨酸、 05%NNP40(pH7.5) 的的裂解液中中 , 冰冰浴 2mmin 后后 9OOOOr/mmin 离离心 8IIIlinno 取上上清与 550 L pooly(rrI):ppoly(rC) 琼脂在 30 共浴 115minn, 离心心去除未吸吸附部分 , 而将将结合物与与 2.55mmollA -322p-AATP 及及磷酸激酶酶在 300 水浴浴 20hh 。将混混合物上 30 L 酸酸性矶土柱柱 , 用用 3mlllmollA 盐酸酸肌洗脱 , 将洗洗脱液与未未用 IFFN 诱导导的对照组组进行比较较便可测出出 IFNN 的活性性。2. 抗增生活活性在含 15% 小牛血清清的 RPPMI16640 培培养基中培培养 5 × 1004 个 /ml Daudda 细胞胞 ,488h 后加加入 IFFN, 再再培养 772h, 用 2BBI 型库库尔特计数数器对细胞胞进行计数数 , 即即可以得到到 IFNN 的抗增增生活性。3. 细胞病变抑制作用将在含 10% 小牛血清的 DMEM 培养液中培养的 WISH 细胞用 0.03%EDTA 、 0.25% 的膜蛋白酶 1mi 在室温下消化 23min 后 , 倒出消化液 , 用 Eagle 液分散细胞 , 然后用含 10% 小牛血清的 DMEM 液配成 5 × 105 个 /ml 的细胞悬液 , 用微量板在37 含 5%C 马的培养箱内培养过夜。用不同稀释度的 0.1ml IFN 溶液加入各孔后再培养 7 h 。每孔加入 0.1ml 含 1001000TcID50 滤过性口腔炎病毒 (VSV) 进行病毒攻击。将病毒对照组与细胞对照组进行比较便可以测得其抗病毒活性。六、新型干扰素1. 活性增加的干扰素通过定点突变或干扰素的嵌合可提高干扰素的活性 , 如将重组干扰素自 17 位的 Cys 改为 Ser, 可提高抗病毒活性 10 倍。新型杂合的 IFN- D 对 NK 细胞的调节能力比亲本提高了 10400 倍 , 如将 IFN- 4 与 IFNtl 进行嵌合 , 得到的 IFN 活性分别是亲代的 4 倍及 20 倍。而用鼠 IFNt1 的 A 段与 IFN- 饨的 B 段进行杂交 , 活性可提高 10100 倍。此外 , 如上面介绍的将 IFN 与 TNF 结合 , 可以产生不同的活性。2. 稳定性增加的干扰素仍以上面提到的重组 IFN R 为例 , 亲代干扰素在一 70 75d 后大多数丧失抗病毒活性 , 而突变后在同样条件下保存 150d 仍不失活。3. 改变抗原性的干扰素如将 IFN 仇的 141 位上 Cys 用 Tyr 代替 , 则其抗原性发生改变 , 不与体内自然存在的 IFN 在 1 争夺受体 , 虽然这种抗原性改变的机率很小 , 但仍不失为一种研究方向。4. 改变种属特异性的干扰素IFN- D 在牛细胞株中活性最高 ,IFN- A 在人细胞系中活性最高 , 而其嵌合体与两个亲本都不相同 , 在鼠细胞中的活性最高。第三节应用一、临临床治疗方方面干扰素素作为较早早被研究的的用基因工工程方法合合成的生物物活性物质质 , 虽虽然在基因因的调取、构构建、表达达方面仍有有较多的工工作在进行行中 , 但研究的的热点已经经转移到了了临床应用用及临床前前的动物实实验方面 , 并且且在较多疾疾病的治疗疗方面取得得了进展。1. 抗病毒目前的研究主要集中于抗各类肝炎病毒方面 , 在抗 HIV 、抗 HSV 等方面也有较多的研究。2. 提高免疫系统机能在小鼠实验中重组 IFN- 对 NK 细胞的活性、吞噬细胞的溶解性、丝裂原诱导的母细胞化均有促进作用 , 同时减少外周血及骨髓量。在牛体内的实验表明 , IFN- 可以增强免疫抑制动物的免疫系统活性。3. 抗肿瘤通过与糖基化的淋巴细胞毒素嵌合 ,IFN- 可以提高小鼠对 HT-1080 纤维肉瘤、 G,361 恶性黑色素瘤、 ZR-75-1 乳腺瘤等肿瘤的抗性。在临床前研究方面 , 重组 IFNek 缸用于扩散性间皮瘤已进入 E 期临床阶段。重组 IFN- 与重组 TNF- 联合用于肿瘤治疗也已完成 I 期临床工作。通过调节单核细胞内腺昔酸环化酶的活性 , 重组 IFN-y 可以对特应性皮炎病人的症状起到一定的缓解作用。通过重组 IFN 吨 C 的抑制增生作用可以防止骨髓异常增生引起的血小板过量溶解。此外 , 抗寄生虫方面的研究表明 ,IFN 作用于宿主细胞 , 可以增强其对寄生虫的抵抗力 O二、基础研究方面利用 PCR 方法可以在干扰素或嵌合干扰素 , 如 IFN- A 心的氨基端加上一段核昔酸序列 :AGA AGG GCA AGT GTT, 其编码的氨基酸序列为 Arg Arg Ma Ser Val, 可以用于 c 灿 fP 的蛋白激酶识别。在 ,32p-ATP 存在的情况下 , 干扰素被 32p 标记且不影响其活性。用这种带有放射性的干扰素可以对干扰素的识别位点及其药物动力学进行研究。狗的 IFN- 与细胞因子和细胞嵌合后可以被抗干扰素的单克隆抗体所识别 , 并且有如下应用 : 水泡性口炎病毒噬菌斑抑制实验 ; 在狗肾实质细胞中两类主要组织相容性复合物抗原基因上游进行调控 ; 在试管中组织相关性淋巴细胞增生的放大中发挥作用 , 利用这个性质可以研究器官移植中细胞因子的活动情况 , 并可用于诊断和治疗。对用基因工程方法生产干扰素已经进行了 40 多年的研究 , 并且取得了较为喜人的成就。 IFN 成为第一个上市的基因工程药物 , 也是一种人们可以用得起的生物活性药物 , 标志了基因工程从实验室研究进入医药临床实践 , 因此是生命科学发展历程中的一个里程碑。但这并不表示基因工程方法在干扰素方面的应用已经没有未开发的领域 , 相反 , 这些成就的取得为新的研究方向的确立以及新的应用提供了思路及条件 , 并为其他生物活性物质的基因工程方法合成提供了一种有益的借鉴 , 在此过程中也促进了其自身的发展。相信在不久的将来 , 基因工程方法生产的干扰素会在疾病的诊断及治疗方面发挥更大的作用 , 同时也成为生命科学研究中的一种有效的工具。