生化分析仪常用分析方法共有三大类分别为终点法、固定时间法和动力学法28344.docx

生化分析仪仪常用分析析方法共有有三大类，分分别为终点点法、固定定时间法和和动力学法法。 终点法：指指经过一段段时间的反反应，反应应达到平衡衡，由于反反应的平衡衡常数很大大，可认为为全部底物物(被测物)转变成产产物，反应应液的吸光光度不再变变化，只与与被测物的的浓度有关关。这类方方法通常称称为“终点”法，更确确切地说应应称“平衡”法。单试剂单波波长终点法法：t1时刻加加入试剂（体体积为V），t2刻加入入样本（体积为SS），然后后搅拌并反反应，之后后开始测量量反应液的的吸光度，在t3时刻刻反应达到到终点，tt3t2为测定定时间。    反反应度RAt3At2-1×V/(VVS)，或RAt3ARBLLK。    其其中：Atti为i时刻的吸吸光度，AARBLKK为试剂空空白吸光度度。单试剂双波波长终点法法：基本上上同“单试剂单单波长终点点法”，只是对对于每一个个测定周期期，其实际际吸光度等等于A1A2。双试剂单波波长终点法法：t1时刻加加入第一试试剂(体积为V11)，t2时刻加加入                                               样样本(体积为S)之后立即即搅拌，tt3时刻加加入第二试试剂(体积为V22)                                                         并并立即搅拌拌，t4时刻反反应达到终终点。t33-t2为为孵育时间间,t4-t3为测测定时间。在项目参数数中，如果果反应起始始时间设为为0，则反应应度R=AA时刻吸光光度-双试剂空空白吸光度度。     如果反应应起始时间间小于0，则反应应度R=AAt4 -双试剂空空白吸光度度-t3到t2间设定定点的吸光光度×（V1S）/(V11SV2)。双试剂双波波长终点法法：基本上上同“双试剂单单波长终点点法”，只是对对于每一个个测定周期期，其实际际吸光度等等于A1A2。固定时间法法：又称为为一级动力力学法、二二点动力学学法等，指指在一定的的反应时间间内，反应应速度与底底物浓度的的一次方成成正比，即即v=kS。由由于底物在在不断的消消耗，因此此整个反应应速度在不不断的减小小，表现为为吸光度的的变化越来来越小。这这类反应达达到平衡的的时间很长长，理论上上可以在任任意时间段段进行监测测，但由于于血清成份份复杂，反反应刚启动动时反应较较复杂，杂杂反应较多多，必需经经过一段延延迟时间才才能进入稳稳定反应期期。t1时刻加加入试剂(体积为V)，之后测测量试剂空空白的吸光光度，t22时刻加入入样本(体积为S)，t3时刻反反应稳定，t4时刻停止对反应进行监测；t2t3为延迟时间，t3t4为测定时间。                                                          单波长反应度（单双试剂相同）：R=At4At3                                                                    双波长反应度：R=（t4时刻主波长吸光度t4时刻次波长吸光度）-（t3时刻主波长吸光度t3时刻次波长吸光度）动力学法：又称零级级动力学法法，指反应应速度与底底物浓度的的零次方成成正比，也也就是与底底物浓度无无关。因此此，在整个个反应过程程中，反应应物可以匀匀速地生成成某个产物物，导致被被测定溶液液在某一波波长下吸光光度均匀地地减小或增增加，减小小或增加的的速度(A/miin)与被被测物的活活性或浓度度成正比。动动力学法也也被称为连连续监测法法；主要用用于酶活性性的测定。    实实际上，由由于底物浓浓度不可能能足够大，随随着反应的的进行，底底物消耗到到一定程度度后，反应应速度不再再为零级，因因此，零级级动力学法法是针对于于特定时间间段而言的的；同样，由由于血清成成份复杂，反反应刚启动动时反应较较复杂，杂杂反应较多多，必需经经过一段延延迟时间才才能进入稳稳定反应期期，各试剂剂商对这两两段时间有有严格规定定。t1时刻加加入试剂(体积为V)，t2时刻加加入样本(体积为S)，t3时刻反反应稳定，tn时刻停止对反应进行监测；t3-t2为延迟时间，tn-t3为测定时间。单波长反应度（单双试剂相同）R（nATAT）/nT2（T）2,其中：nt3到tn间的数据个数，T时间， A=某一时间的吸光度。双波长反应度基本同单波长，只是某一时间的吸光度等于主波长吸光度减去次波长吸光度。第二章生化自动化化分析方法法概要一、分析方方法分类（一）终点点法被测物质在在反应过程程中完全被被转变为产产物，即达达到反应终终点，根据据终点吸光光度的大小小求出被测测物浓度，称称为终点法法（endd esssay）。实实际上被测测物并没有有完全被转转变，而只只是与产物物达到一个个动态的化化学平衡，因因此该法称称为平衡法法更为恰当当。从时间间-吸光度度曲线来看看，到达反反应终点或或平衡点时时，吸光度度将不再变变化。分析析仪通常在在反应终点点附近连续续选择两个个吸光度值值，求出其其平均值计计算结果，并并可根据两两点的吸光光度差来判判断反应是是否到达反反应终点。终终点法参数数设置简单单，反应时时间一般较较长，精密密度较好。终点时间的的确定：根据时间间-吸光度度曲线来确确定，如TTrindder反应应测定尿酸酸，反应曲曲线上35minn时其吸光光度已趋向向稳定，因因而可将55min作作为反应终终点。根据被测测物反应终终点，结合合干扰物的的反应情况况来确定，如如在血清白白蛋白的溴溴甲酚绿法法测定中，白白蛋白与溴溴甲酚绿在在10s内内很快完成成反应，之之后球蛋白和和球蛋白与与溴甲酚绿绿发生 ""慢反应""，使反应应曲线上吸吸光度在110s后仍仍继续缓慢慢上升，持持续约达110minn，因此终终点时间应应采用10030ss，而不应应选择100min。1一点终终点法 ：在反应到到达终点，即即在时间-吸光度曲曲线上吸光光度不再改改变时选择择一个终点点吸光度值值，这种方方法称为一一点终点法法（onee poiint eend eessayy），其反反应曲线见见图7-33。其检测测结果的计计算公式是是：待测物物浓度CUU=（待测测吸光度AAU试剂剂空白吸光光度AB）×K。 K为校准系数，详见第五节二操作方法。 2两点终终点法 ：在被测物物反应或指指示反应尚尚未开始时时，选择第第一个吸光光度，在反反应到达终终点或平衡衡时选择第第二个吸光光度，此两两点吸光度度之差用于于计算结果果，称为两两点终点法法（twoo poiint eend eessayy），其反反应曲线见见图7-44。计算公公式为CUU=（待测测吸光度AA2待测测吸光度AA1）×K。该法法能有效地地消除溶血血（hemmolyssis）、黄黄疸（iccteruus）和脂脂浊（liipo-tturbiid）等样样品本身光光吸收（见见图7-55）造成的的干扰。在在单试剂分分析加入试试剂的初期期、或双试试剂分析中中第二试剂剂加入之初初，若指示示反应吸光光度尚未明明显变化，则则可在此时时选择第一一个吸光度度，在指示示反应终点点时选择第第二个吸光光度，从而而设置成两两点终点法法。但指示示反应初期期吸光度无无明显变化化的化学反反应较少，如如单试剂方方式测定总总蛋白、白白蛋白、钙钙、磷、镁镁等的终点点法分析项项目，及双双试剂方式式测定葡萄萄糖、总胆胆固醇、甘甘油三酯等等的终点法法分析项目目，因反应应初期吸光光度已有明明显变化，因因而均难以以用上述方方式设置两两点终点法法。但在双双试剂分析析中，如果果将第一吸吸光度选择择在第二试试剂加入前前，此时指指示反应一一般尚未开开始，则能能容易设置置两点终点点法。在此此要注意必必须将两次次读吸光度度时不同比比色液体积积进行校正正。目前全全自动分析析仪均具有有此自动校校正功能，不不必手工进进行校正。（二）固定定时间法指在时间-吸光度曲曲线上选择择两个测光光点，此两两点既非反反应初始吸吸光度亦非非终点吸光光度，这两两点的吸光光度差值用用于结果计计算，称为为固定时间间法（fiixed-timee esssay），反反应曲线见见图7-66。其计算算公式与两两点终点法法相同，为为CU=(A2-AA1)×K。有时时也称此法法为两点法法。该分析方法法有助于解解决某些反反应的非特特异性问题题。例如：苦味酸法法测定肌酐酐，反应的的最初300s内，血血清中快反反应干扰物物（如微生生物、丙酮酮酸、乙酰酰乙酸等）能能与碱性苦苦味酸反应应；在第二二个30ss时碱性苦苦味酸主要要与肌酐反反应，且此此段时间吸光度曲曲线的线性性较好（故故也可用连连续监测法法测定肌酐酐）；在8801220s及其其以后，碱碱性苦味可可与蛋白质质以及其它它慢反应干干扰物反应应。这样选选用反应的的第二个330s为测测定时间，既既避免了快快反应物质质的干扰，也也避免了慢慢反应物质质的影响，使使肌酐浓度度与吸光度度变化呈良良好的线性性关系，有有利于提高高分析的特特异性和准准确度。（三）连续续监测法连续监测法法（conntinuuous moniitoriing eessayy）又称速速率法（rrate essaay），是是在测定酶酶活性或用用酶法测定定代谢产物物时，连续续选取时间间-吸光度度曲线中线线性期的吸吸光度值，并并以此线性性期的单位位吸光度变变化值（A/miin）计算算结果，见见图7-77A和B。所所谓线性期期就是各点点吸光度差差值相等，如如图7-77C所示，图图中1及5值偏小小，而234，故AA1点至AA4点属线线性段。此此线性期对对底物来说说属零级反反应，期间间的A/miin即为酶酶促反应的的初速度，其其大小与被被测酶活性性成正比。连连续监测法法的优点即即是可以确确定线性期期并计算A/miin，根据据此值再准准确地计算算酶活性，因因而使自动动生化分析析仪在酶活活性测定方方面显著地地优于手工工法。连续续监测法也也可用于测测定呈线性性反应的代代谢物浓度度，一般是是某些基于于酶法测定定的代谢物物。酶活性性（U/LL）A/miin×理论（或或校准）KK值，代谢谢物浓度CCU=A/miin×校准K值值。关于理理论K值和和校准K值值叙述如下下：1理理论K值：多用于于酶活性测测定中，因因酶活性尚尚无公认的的校准品可可用，因而而根据酶活活性的国际际单位定义义得出酶活活性的计算算公式为：酶活性 (U/LL)=A/miin× ，将此此式中 以以K来表示示，此K值值可通过对对已知值即即指示物质质的毫摩尔尔消光系数数（）、反应应液总容量量（TV）、样样品容量（SSV）和比比色杯光径径（d）计计算后得出出，即为理理论K值，可可作为分析析参数输入入到分析仪仪中。采用理论KK值的前提提应当是样样品和试剂剂的加量准准确、比色色杯光径准准确、温度度控制精确确以及波长长准确等。但但事实上由由于各型分分析仪在注注射器容积积步进电机机精度、滤滤光片带宽宽等方面的的差异，可可造成样品品和试剂加加量以及吸吸光度检测测的偏差。温温度的影响响有时也非非常大，由由于反应盘盘是半暴露露的，因此此随着较冷冷试剂的加加入，反应应盘中的温温度会逐渐渐降低，尽尽管开始测测定时反应应盘温度已已升到377°C，但在在某一项目目测定过程程的开始阶阶段，温度度可能达不不到37°°C ，甚甚至仅355°C左右，且且反应过程程中仍有可可能上下波波动，这对对于酶学反反应来说影影响是很大大的。如采采用37°°C时的理理论K值，将将会使测定定结果降低低，温度的的波动还会会使得结果果的重复性性降低。当当然，若试试剂在加入入反应杯前前经试剂臂臂内加热装装置预温，则则基本不影影响反应盘盘温度。由于摩尔吸吸光系数受受比色杯光光径、波长长、带宽以以及加样系系统的准确确性等的影影响，书本本上或试剂剂厂家提供供的理论摩摩尔吸光系系数可能与与实际所用用分析仪所所测的不同同，因而有有必要获得得实际的摩摩尔吸光系系数，然后后用来计算算的K值称称为实测KK值。（1）NAADH（NNADPHH）摩尔吸吸光系数的的测定：NNADH（NNADPHH）没有标标准纯制品品，而且配配成溶液后后稳定性又又较差，不不能直接用用NADHH 或NAADPH标标准液来校校正仪器，须须通过有NNAD+(NADPP+)参与与的反应途途径。用已已糖激酶 (HK)或葡萄糖糖脱氢酶(GD)方方法测定葡葡萄糖时，葡葡萄糖的消消耗与NAADH的生生成呈等摩摩尔关系。葡葡萄糖有标标准纯制品品，又有国国家批准文文号的葡葡葡糖标准液液。因此，根根据公式AA=bC，已已知比色杯杯光径b和和葡萄糖标标准液浓度度，测得葡葡萄糖标准准管的吸光光度A后便便可计算出出NADHH（NADDPH）的的摩尔吸光光系数为 A/bC。假假设，葡萄萄糖标准液液浓度为11Ommoo1/L(0.011mol/L)，标标准液加入入量为3.5L，酶试试剂加入量量为3355L，比色色杯光径为为0.7ccm，在3340nmm测得吸光光度为0.465，则则实测NAADH摩尔尔吸光系数数= 66424，即在此此台分析仪仪上3400nm波长长处测得NNADH（NNADPHH）的摩尔尔吸光系数数为64224，而理理论上NAADH（NNADPHH）的为62220。（2）"色色素原"酶酶促产物在在405nnm波长摩摩尔吸光系系数的测定定：有许多多酶底物为为人工合成成的"色素素原"底物物，其本身身无色，经经酶作用后后释放出有有色的反应应产物，在在405nnm波长具具有吸收峰峰。最常用用色素原底底物及其产产物为: ALP测测定以磷酸酸对硝基苯苯酚 (44-Nittrophhenyll phoosphaate，44-NPPP)为底物物，经酶作作用后释放放出黄色的的对硝基苯苯酚(4-Nitrropheenol，44-NP)，GGTT测定以-L-谷谷氨酰对硝硝基苯胺(-L-GGlutaamyl-p-niitroaaniliide)或或-L-谷谷氨酰-33-羟基-对硝基苯苯胺(-L-GGlutaamyl-3-caarboxxyl-pp-nittroann)为底物物，经酶作作用后释放放出黄色的的对硝基苯苯胺(p-Nitrroaniilinee，4-NNA)或对对硝基-55-氨基苯苯甲酸(22-amiino-nnitroobenzzoicaacid， ANBAA)。对硝硝基苯酚的的摩尔吸光光系数为1187000(4055nm)，对对硝基苯胺胺的摩尔吸吸光系数为为98700(4055nm)，对对硝基-55-氨基苯苯甲酸的摩摩尔吸光系系数为94490(4405nmm)。下面面是对硝基基苯酚的摩摩尔吸光系系数测定方方法。试剂： 4-NPP标准储存存液(1OOmmo11/L)。 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成)。 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37,pH l0.09土0.02)。测定方法：4-NPP标准液加加入量为55L，底物物缓冲液加加入量为3350L，波长长405nnm，光径径0.7ccm，温度度37，测定得得吸光度为为A1；另另用蒸馏水水代替4-NP标准准液，按上上述方法测测定其吸光光度为A22，4-NNP标准液液吸光度A= AA1- AA2，若测测得A为0.460，则则实测4-NNP摩尔吸吸光系数 1886622校准KK值酶活活性校准品品经校准操操作后由分分析仪自动动计算得出出。在进行行酶学测定定时，如果果分析条件件的变化如如温度、样样品试剂加加量和吸光光度检测偏偏差可同等等程度地影影响校准物物和待测样样品，则使使用校准品品能进行补补偿。一般般来说以使使用校准KK值为好，但但必须有两两个先决条条件：必须使用用配套的试试剂；必须使用用配套的高高质量的校校准品，该该校准品应应具有溯源源性。使用用与该分析析仪配套的的酶活性校校准品也可可得到较好好的酶活性性测定结果果。关于酶酶活性标准准品，欧洲洲标准局（BBCR）和和美国国家家标准技术术研究院（NNIST）均均发表了人人血清基质质的酶活性性标准物，但但目前尚无无公认的标标准（校准准）品问世世。（四）透射射比浊法 抗原与相应应的抗体结结合形成的的免疫复合合物，在反反应液中具具有一定的的浊度，可可由一般分分光光度法法进行透射射比浊（ttranssmisssion turbbidimmetryy）测定，可可用于某些些蛋白质和和药物浓度度等的测定定。该法须须做多点校校准，再经经非线性回回归，求出出抗原或抗抗体的含量量。使用散散射比浊法法（scaatterr turrbidiimetrry）能更更加准确快快速地检测测抗原抗体体形成浊度度的大小或或其速度，目目前专用的的特定蛋白白分析仪可可做此法检检测。有关关免疫比浊浊法原理详详见第二章章。二、常用生生化检测项项目分析方方法举例1终终点法检测测常用的的有总胆红红素（氧化化法或重氮氮法）、结结合胆红素素（氧化法法或重氮法法）、血清清总蛋白（双双缩脲法）、血血清白蛋白白（溴甲酚酚氯法）、总总胆汁酸（酶酶法）、葡葡萄糖（葡葡萄糖氧化化酶法）、尿尿酸（尿酸酸酶法）、总总胆固醇（胆胆固醇氧化化酶法）、甘甘油三酯（磷磷酸甘油氧氧化酶酶法法）、高密密度脂蛋白白胆固醇（直直接测定法法）、钙（偶偶氮砷法）、磷磷（紫外法法）、镁（二二甲苯胺蓝蓝法）等。以以上项目中中，除钙、磷磷和镁基本本上还使用用单试剂方方式分析因因而采用一一点终点法法外，其它它测定项目目都可使用用双试剂故故能选用两两点终点法法，包括总总蛋白、白白蛋白测定定均已有双双试剂可用用。2固固定时间法法苦味酸酸法测定肌肌酐采用此此法。3连连续监测法法对于酶酶活性测定定一般应选选用连续监监测法，如如丙氨酸氨氨基转移酶酶、天冬氨氨酸氨基转转移酶、乳乳酸脱氢酶酶、碱性磷磷酸酶、谷氨氨酰酰基转移酶酶、淀粉酶酶和肌酸激激酶等。一一些代谢物物酶法测定定的项目如如己糖激酶酶法测定葡葡萄糖、脲脲酶偶联法法测定尿素素等，也可可用连续监监测法。4透射比比浊法透透射比浊法法可用于测测定产生浊浊度反应的的项目，多多数属免疫疫比浊法，载载脂蛋白、免免疫球蛋白白、补体、抗抗"O"、类类风湿因子子，以及血血清中的其其他蛋白质质如前白蛋蛋白、结合合珠蛋白、转转铁蛋白等等均可用此此法。第三章常用生化检检测项目分分析方法举举例及参数数设置一、常用生生化检测项项目分析方方法举例1终点法法检测常常用的有总总胆红素（氧氧化法或重重氮法）、结结合胆红素素（氧化法法或重氮法法）、血清清总蛋白（双双缩脲法）、血血清白蛋白白（溴甲酚酚氯法）、总总胆汁酸（酶酶法）、葡葡萄糖（葡葡萄糖氧化化酶法）、尿尿酸（尿酸酸酶法）、总总胆固醇（胆胆固醇氧化化酶法）、甘甘油三酯（磷磷酸甘油氧氧化酶酶法法）、高密密度脂蛋白白胆固醇（直直接测定法法）、钙（偶偶氮砷法）、磷磷（紫外法法）、镁（二二甲苯胺蓝蓝法）等。以以上项目中中，除钙、磷磷和镁基本本上还使用用单试剂方方式分析因因而采用一一点终点法法外，其它它测定项目目都可使用用双试剂故故能选用两两点终点法法，包括总总蛋白、白白蛋白测定定均已有双双试剂可用用。2固定时时间法苦苦味酸法测测定肌酐采采用此法。3连续监监测法对对于酶活性性测定一般般应选用连连续监测法法，如丙氨氨酸氨基转转移酶、天天冬氨酸氨氨基转移酶酶、乳酸脱脱氢酶、碱碱性磷酸酶酶、谷氨氨酰酰基转移酶酶、淀粉酶酶和肌酸激激酶等。一一些代谢物物酶法测定定的项目如如己糖激酶酶法测定葡葡萄糖、脲脲酶偶联法法测定尿素素等，也可可用连续监监测法。4透射比比浊法透透射比浊法法可用于测测定产生浊浊度反应的的项目，多多数属免疫疫比浊法，载载脂蛋白、免免疫球蛋白白、补体、抗抗"O"、类类风湿因子子，以及血血清中的其其他蛋白质质如前白蛋蛋白、结合合珠蛋白、转转铁蛋白等等均可用此此法。二、分析参参数设置分析仪的一一些通用操操作步骤如如取样、冲冲洗、吸光光度检测、数数据处理等等，其程序序均已经固固化在存储储器里，用用户不能修修改。各种种测定项目目的分析参参数（annalyssispaarameete）大大部分也已已设计好，存存于磁盘中中，供用户户使用；目目前大多数数生化分析析仪为开放放式，用户户可以更改改这些参数数。生化分分析仪一般般另外留一一些检测项项目的空白白通道，由由用户自己己设定分析析参数。因因此必须理理解各参数数的确切意意义。一、分析参参数介绍（一）必选选分析参数数这类参数是是分析仪检检测的前提提条件，没没有这些参参数无法进进行检测。1试验名名称试验名名称（teest ccode）是是指测定项项目的标示示符，常以以项目的英英文缩写来来表示。2方法类类型（也称称反应模式式）方法类类型（asssay）有有终点法、两两点法、连连续监测法法等，根据据被检物质质的检测方方法原理选选择其中一一种反应类类型。3反应温温度一般有有30、37可供选择择，通常固固定为377。4主波长长主波长（pprimaary wwavellengtth）是指指定一个与与被测物质质反应产物物的光吸收收有关的波波长。5次波长长次波长（sseconndaryy wavvelenngth）是是在使用双双波长时，要要指定一个个与主波长长、干扰物物质光吸收收有关的波波长。6反应方方向反应方方向（reesponnse ddirecctionn）有正向向反应和负负向反应两两种，吸光光度增加为为正向反应应，吸光度度下降为负负向反应。7样品量量样品量（ssamplling voluum）一般般是2l35l，以0.11l步进，个个别分析仪仪最少能达达到1.66l。可设置置常量、减减量和增量量。8第一试试剂量第一一试剂量（first regengt volum）一般是20300l，以1l步进。9第二试试剂量第二二试剂量（second regengt volum）一般也是20300l，以1l步进。10总反反应容量总总反应容量量（tottal rreactting voluum）在不不同的分析析仪有一个个不同的规规定范围，一一般是1880350l，个别仪仪器能减少少至1200l。总反应应容量太少少无法进行行吸光度测测定。11孵育育时间孵育育时间（iincubbate timee）在终点点法是样品品与试剂混混匀开始至至反应终点点为止的时时间，在两两点法是第第一个吸光光度选择点点开始至第第二个吸光光度选择点点为止的时时间。12延迟迟时间延迟迟时间（ddelayy timme）在连连续监测法法中样品与与反应试剂剂（第二试试剂）混匀匀开始至连连续监测期期第一个吸吸光度选择择点之间的的时间。13连续续监测时间间连续监测测时间（ccontiinuouus moonitooringg timme）在延延迟时间之之后即开始始，一般为为60120ss，不少于于4个吸光度度检测点（3个吸光度变化值）。14校准准液个数及及浓度校准准曲线线性性好并通过过坐标零点点的，可采采用一个校校准液（ccalibbratoor）；线线性好但不不通过坐标标零点，应应使用两个个校准液；对于校准准曲线呈非非线性者，必必须使用两两个以上校校准液。每每一个校准准液都要有有一个合适适的浓度。15校准准K值或理论论K值通过校准准得到的KK值为校准准K值（callibraate ccoeffficieent）或或由计算得得出的K值为理论论K值。16线性性范围即方方法的线性性范围（llineaarityy rannge），超超过此范围围应增加样样品量或减减少样品量量重测。与与试剂/样品比值值有关。17小数数点位数检检测结果的的小数点位位数（deecimaal pooint digiit）。（二）备选选分析参数数这类分析参参数与检测测结果的准准确性有关关，一般来来说不设置置这类分析析参数，分分析仪也能能检测出结结果，但若若样品中待待测物浓度度太高等，检检测结果可可能不准确确。1样品预预稀释设置置样品量、稀稀释剂量和和稀释后样样品量三个个数值，便便可在分析析前自动对对样品进行行高倍稀释释。2底物耗耗尽值底物物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。3前区检检查免疫比比浊法中应应用，以判判断是否有有抗原过剩剩。将终点点法最后两两个吸光度度值的差别别（A）设置一一个限值，如如果后一点点的吸光度度比前一点点低，表示示已有抗原原过剩，应应稀释样品品后重测。4试剂空空白吸光度度范围超过过此设定范范围表示试试剂已变质质，应更换换合格试剂剂。5试剂空空白速率连连续监测法法中使用，是是试剂本身身在监测过过程中没有有化学反应应时的变化化速率。6方法学学补偿系数数用于校准准不同分析析方法间测测定结果的的一致性，有有斜率和截截距两个参参数。7参考值值范围对超超过此范围围的测定结结果，仪器器会打印出出提示。（三）某些些参数的特特殊意义1最小样样品量最小小样品量是是指分析仪仪进样针能能在规定的的误差范围围内吸取的的最小样品品量。一般般分析仪的的最小样品品量是2l，目前也也有小至11.6l的。在样样品含高浓浓度代谢产产物或高活活性酶浓度度的情况下下往往需采采用分析仪仪的最小样样品量作为为减量参数数，从而使使分析仪检检测范围（与与线性范围围不同）的的上限得以以扩大。2最大试试剂量方法法灵敏度很很高而线性性上限低的的检测项目目，如血清清白蛋白的的溴甲酚氯氯法测定，以以往手工法法操作时样样品量100l，试剂量量4ml，这这样试剂量量/样品量比比例（R/S）为2000，线性上上限则为660g/LL。此法移移植到分析析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。3弹性速速率在酶活活性测定中中，当酶活活性太高，在在连续监测测期中已不不呈线性反反应时，有有些仪器具具有弹性速速率（fllexraate）功功能，能自自动选择反反应曲线上上连续监测测期中仍呈呈线性的吸吸光度数据据计算结果果，使酶活活性测定的的线性范围围得以扩大大。如ASST可从10000U/LL扩展至40000U/L，从而而减少稀释释及重测次次数、降低低成本。4试剂空空白速率当当样品中存存在胆红素素时，胆红红素对碱性性苦味酸速速率法或两两点法测定定肌酐有负负干扰。因因为胆红素素在肌酐检检测的波长长505nnm有较高高光吸收，而而且胆红素素在碱性环环境中可被被氧化转变变，因而在在肌酐反应应过程中胆胆红素的光光吸收呈下下降趋势。若若在加入第第一试剂后后一段时间间内设置试试剂空白速速率，因为为此段中苦苦味酸尚未未与肌酐反反应，而胆胆红素在第第一试剂的的碱性环境境中已同样样被氧化转转变，因而而以第二试试剂加入后后的速率变变化，减去去试剂空白白速率变化化，便可消消除胆红素素的负干扰扰，见图77-8。二、单波长长和双波长长方式（一）概念念采用一个波波长检测物物质的光吸吸收强度的的方式称为为单波长(monoo-wavvelenngth)方式。当当反应液中中含有一种种组分，或或在混合反反应液中待待测组分的的吸收峰与与其它共存存物质的吸吸收波长无无重叠时，可可以选用。在在吸光度检检测中，使使用一个主主波长和一一个次波长长的称双波波长方式。当当反应液中中存在干扰扰物的较大大吸收、从从而影响测测定结果的的准确性时时，采用双双波长方式式更好。（二）双波波长的作用用双波长(ddi-waaveleengthh)测定优优点是消除噪音音干扰;减少杂散散光影响;减少样品品本身光吸吸收的干扰扰。从光源源，到比色色杯、单色色器、检测测器的整个个光路系统统中，均存存在着随时时间发生变变化的不稳稳定的检测测信号，即即噪音，而而双波长检检测是同时时进行的，两两种波长检检测产生的的噪音基本本上相同，因因而能消除除噪音干扰扰。当样品品中存在非非化学反应应的干扰物物如甘油三三酯、血红红蛋白、胆胆红素等时时，会产生生非特异性性的光吸收收，而干扰扰测定结果果的准确性性。采用双双波长方式式测定可以以部分消除除这类干扰扰，提高检检测的准确确性。（三）次波波长的确定定方法当被测物的的主波长确确定之后，再再选择次波波长。如根根据甘油三三酯等干扰扰物吸收光光谱特征，选选择次波长长，使干扰扰物在主、次次波长处有有尽可能相相同的光吸吸收值，而而被测物在在主、次波波长处的光光吸收值应应有较大的的差异。一一般来说，次次波长应大大于主波长长100nnm。以主主波长与次次波长吸光光度差来计计算结果。（四）双波波长的具体体应用对于某些反反应速度快快且无法设设置为两点点终点法的的分析项目目，尤其是是单试剂分分析中，可可以利用双双波长的方方式来部分分消除样品品本身的光光吸收干扰扰。目前用用单试剂法法测定的项项目应用双双波长的为为血清总蛋蛋白（双缩缩脲法）主主波长5000nm，次次波长5776nm；血清白蛋蛋白（溴甲甲酚氯法）主主、次波长长分别为6600和700nnm；钙（偶偶氮砷法）主、次次波长分别别为 6660、770nnm；磷（紫紫外比色法法）主、次次波长为3340、405nnm，镁（二二甲苯胺蓝蓝法）主、次次波长为5505和 6000nm。三、单试剂剂和双试剂剂方式反应过程中中只加一次次试剂称单单试剂方式式，加两次次试剂便为为双试剂方方式。目前前的生化分分析仪大多多可用双试试剂方式分分析，其优优点是：可提高试试剂的稳定定性，多数数双试剂混混合成单一一工作试剂剂时，其稳稳定时间缩缩短；能设置两两点终点法法，来消除除来自样品品本身的光光吸收干扰扰；在某些项项目检测时时能消除非非特异性化化学反应的的干扰。如如血清ALLT测定，血血清中的内内源性丙酮酮酸及其它它酮酸也可可与试剂中中的指示酶酶（乳酸脱脱氢酶）起起反应，使使结果偏高高。若先加加入缺乏-酮戊二酸酸的第一试试剂，使其其它酮酸与与指示酶反反应之后再再加入含有有-酮戊二酸酸的第二试试剂，启动动真正的AALT酶促促反应生成成丙酮酸，而而丙酮酸与与乳酸脱氢氢酶的反应应消耗的NNAD能能真正反映映ALT的活活性，从而而消除以上上副反应的的影响。四、测定过过程的自动动监测各种自动生生化分析仪仪或多或少少都具有对对测定过程程进行各种种监测的功功能，以便便在没有人人"监督"化学反应应的情况下下提高检测测的准确性性。高档分分析仪的监监测功能更更强。1试剂空空白监测每每种试剂都都有一定的的空白吸光光度范围，试试剂空白吸吸光度的改改变往往提提示着该试试剂的变质质：如利用用Trinnder反反应为原理理的检测试试剂会因酚酚被氧化为为醌而变为为红色；碱碱性磷酸酶酶、谷氨酰酰转移酶、淀淀粉酶等检检测试剂会会因基质分分解出硝基基酚或硝基基苯胺而变变黄；有些些试剂久置置后变浑浊浊。这些情情况均可使使空白吸光光度升高。丙丙氨酸氨基基转移酶、天天冬氨酸氨氨基转移酶酶等负反应应检测项目目，其试剂剂在放置过过程中空白白吸光度会会因NADDH自行氧氧化为NAAD+而下下降等。试剂空白的的测定方法法有两种：每瓶试剂剂在使用前前通过对试试剂空白校校准来确定定试剂空白白吸光度，这这种方式适适用于先取取样品后加加试剂的分分析仪。每个样品品测定前均均检测试剂剂空白吸光光度，适用用于先加试试剂后取样样品的分析析仪。2试剂空空白变化速速率监测一一些酶试剂剂在反应温温度下不稳稳定，其空空白吸光度度可随着时时间逐渐发发生变化，这这种变化的的主要原因因与工具酶酶或辅酶的的纯度有关关，且因试试剂的组成成和生产厂厂家的不同同而不同。这这种变化会会影响测定定结果的准准确性，一一般使结果果偏高。如如果设置此此项监测，分分析仪在结结果计算时时会自动减减去试剂空空白变化速速率。在以以监测NAAD（P）H减少为指指示反应的的酶活性测测定中，空空白速率可可监测并消消除由NAADH自身身氧化所造造成的吸光光度下降；在色素原原为底物的的酶活性测测定中，空空白速率可可监测并消消除底物自自身分解造造成的吸光光度升高。有有关空白速速率监测在在胆红素对对碱性苦味味酸速率法法测定肌酐酐负干扰消消除中的作作用，已如如前述。3样品信信息监测由由于样品的的溶血、脂脂浊、黄疸疸会对测定定结果产生生非化学反反应的干扰扰。根据溶溶血、脂浊浊、黄疸的的光谱吸收收特性，用用双波长或或多波长检检测其性质质和程度，一一般是测定定样品在6600nmm570nnm、700nnm/6660nm和和505nnm/4880nm吸吸光度比值值的大小来来分别判断断样品溶血血、脂浊和和黄疸程度度。然后在在结果计算算时自动减减去这部分分干扰，这这将有利于于提高分析析结果的可可靠性。4结果可可靠性监测测（1）终点点监测：终终点法测定定要判断所所选的测光光点是否到到达终点或或平衡点。一一些分析仪仪在所选终终点后再选选一个测光光点，比较较这两点吸吸光度的差差异来判断断反应是否否到达终点点。（2）线性性期监测：连续监测测法选择时时间吸光光度反应曲曲线上的线线性期来计计算酶活性性或被测物物浓度，因因此仪器要要确定此连连续监测期期是否呈线线性。其监监测方法为为将连续监监测到的各各吸光度值值进行线性性回归，计计算出各点点的方差，根根据方差值值的大小来来判断是否否呈线性；取连续监监测期开始始若干点的的变化速率率与连续监监测期最后后若干点的的变化速率率进行比较较，来判断断是否为线线性期。5底物消消耗的监测测在连续监监测法测定定酶活性时时，如果在在监测期内内吸光度上上升或下降降超过其底底物耗尽值值，则说明明该样品酶酶活性非常常高，底物物将被耗尽尽，监测期期的吸光度度将偏离线线性，使测测定结果不不可靠。此此时不打印印结果或打打印结果同同时也打印印出底物耗耗尽提示，该该样品应稀稀释一定的的倍数重新新测定。此此监测对于于采用负反反应分析酶酶活性的方方法甚为重重要。见图图7-96方法线线性范围监监测每种待待测物分析析都有一个个可测定的的浓度或活活性范围，样样品结果若若超过此范范围，分析析仪将显示示测定结果果超过线性性范围的提提示，多数数分析仪会会自动将样样品减量或或增量重新新测定。第四章标准品和校校准品传统的临床床检验，要要使检验结结果可靠或或有依据，往往往有一个个标准品(Stanndardd)。以临临床化学检检验的比色色测定为例例，常作三三个检测：空白、标标准、测定定。用空白白液调整吸吸光度为零零，读出测测定比色液液和标准比比色液的吸吸光度，分分别为Ass和Au；已知知标准液浓浓度为Css。在一定定范围内，某某分析物浓浓度和吸光光度呈良好好比例关系系。为了克克服纯标准准液和病人人样品间的的基体差异异，20年前开开始引用具具有与病人人样品基体体相似的校校准品替代代标准品，用用于日常工工作。由于于以往在使使用标准品品时不强调调它的专用用性，国内内在应用校校准品时忽忽略了它的的专用性。任任何方法或或仪器、试试剂使用一一个校准品品，严重影影响检验质质量。一、标准液液的定值一般而言，检检验工作使使用的标准准品属应用用标准。配配制或供应应这类标准准