醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量.ppt

实验五实验五 醋酸纤维薄膜电泳分离血醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质并定量清蛋白质并定量目的目的vv学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和方法理和方法 vv学习蛋白质染色的方法学习蛋白质染色的方法 vv了解电泳法分离血清蛋白质的临床意义了解电泳法分离血清蛋白质的临床意义 原原 理理vv1、电泳（、电泳（electrophoresis）法）法vv在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子带电荷的蛋白质，在等电状态的蛋白质分子带电荷的蛋白质，在电场中将向着与其所带电荷电性相反的电极电场中将向着与其所带电荷电性相反的电极泳动这种现象称为电泳。泳动这种现象称为电泳。电泳影响因素电泳影响因素vv蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量及质点的大小和形状；带的电荷性质、数量及质点的大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的液的PH、离子强度及电渗等。、离子强度及电渗等。常见的有：常见的有：醋酸纤维膜电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳毛细管电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳vv醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜作为支持介质 vv醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为膜，其厚度为0.10.15mm血浆蛋白：血浆蛋白：vv(1)(1)清蛋白（清蛋白（清蛋白（清蛋白（AlbAlb）、）、）、）、11、22、纤维蛋白原和、纤维蛋白原和、纤维蛋白原和、纤维蛋白原和-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 ;vv(2)(2)血浆中蛋白质的血浆中蛋白质的血浆中蛋白质的血浆中蛋白质的PIPI小于小于小于小于7.07.0，在，在，在，在PH8.6 BufferPH8.6 Buffer中中中中解离成负离子，在电场中向正极移动。解离成负离子，在电场中向正极移动。解离成负离子，在电场中向正极移动。解离成负离子，在电场中向正极移动。vv(3)(3)在同一在同一在同一在同一pHpH下所带电荷量多少有差异，各蛋白质下所带电荷量多少有差异，各蛋白质下所带电荷量多少有差异，各蛋白质下所带电荷量多少有差异，各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因而在同一电场的分子大小与分子形状也不相同，因而在同一电场的分子大小与分子形状也不相同，因而在同一电场的分子大小与分子形状也不相同，因而在同一电场中泳动速度不同中泳动速度不同中泳动速度不同中泳动速度不同 。染色剂染色剂vv一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红丽春红 vv糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂试剂 vv脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色 vv白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白 vva1-a1-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 vva2-a2-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 vv-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 vv 球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白vv醋酸纤维薄膜法显示血清蛋白质从阳极端起依醋酸纤维薄膜法显示血清蛋白质从阳极端起依醋酸纤维薄膜法显示血清蛋白质从阳极端起依醋酸纤维薄膜法显示血清蛋白质从阳极端起依 vv次为白蛋白、次为白蛋白、次为白蛋白、次为白蛋白、a1-a1-球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、a2-a2-球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 vv和和和和 球蛋白五条区带球蛋白五条区带球蛋白五条区带球蛋白五条区带 。定量定量vv与蛋白质结合的染料可溶解于碱液，溶液颜与蛋白质结合的染料可溶解于碱液，溶液颜色深浅与蛋白质量呈正比色深浅与蛋白质量呈正比 比色法比较各蛋白比色法比较各蛋白质条带溶于碱后的溶液颜色，可计算出各种质条带溶于碱后的溶液颜色，可计算出各种蛋白质所占的百分比蛋白质所占的百分比计算计算vvOD总和总和 T A +1+2+vv白蛋白白蛋白 A/T 100 vv1球蛋白球蛋白 1/T 100 vv2球蛋白球蛋白 2/T 100 vv球蛋白球蛋白 /T 100 vv球蛋白球蛋白 /T 100操 作vv1、准备、准备（1）电泳仪的准备）电泳仪的准备（2）薄膜的准）薄膜的准备：备：vv在薄膜无光泽面标记点样位置在薄膜无光泽面标记点样位置 vv将薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡将薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡2 2、点样、点样v（1）无光泽面朝上，吸去多余无光泽面朝上，吸去多余无光泽面朝上，吸去多余无光泽面朝上，吸去多余Buffer,Buffer,vv（2 2）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线 vv 处。处。处。处。v注意：注意：不能超出边缘；不能重复点样；必须与边不能超出边缘；不能重复点样；必须与边不能超出边缘；不能重复点样；必须与边不能超出边缘；不能重复点样；必须与边缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜 。vv3 3、平衡：、平衡：、平衡：、平衡：vv 无光泽面朝下，点样侧位于阴极（无光泽面朝下，点样侧位于阴极（无光泽面朝下，点样侧位于阴极（无光泽面朝下，点样侧位于阴极（5min)5min)vv4 4、电泳：、电泳：、电泳：、电泳：vv 打开电源，打开电源，打开电源，打开电源，U U160V160V或或或或I I1.6mA 1.6mA vv t=45 t=4550min50min；冬季；冬季；冬季；冬季1 1小时小时小时小时 vv5 5、染色：氨基黑、染色：氨基黑、染色：氨基黑、染色：氨基黑10B 10B vv 染色充分，染色充分，染色充分，染色充分，5 510min 10min vv6 6、漂洗：、漂洗：、漂洗：、漂洗：vv 3 34 4个漂洗皿，洗去染料至背景无色。个漂洗皿，洗去染料至背景无色。个漂洗皿，洗去染料至背景无色。个漂洗皿，洗去染料至背景无色。临床意义临床意义vv血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为606080g/L 80g/L，绝大部分由肝脏合成，仅绝大部分由肝脏合成，仅绝大部分由肝脏合成，仅绝大部分由肝脏合成，仅 球蛋白由浆细胞合成球蛋白由浆细胞合成球蛋白由浆细胞合成球蛋白由浆细胞合成 vv正常值：正常值：正常值：正常值：白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白57577272 vv 11球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白2 255 vv 22球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白4 499 vv 球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白6.56.51212 vv 球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白12122020 vv血浆蛋白的主要功能血浆蛋白的主要功能 vv维持血浆胶体渗透压维持血浆胶体渗透压 vv调节血浆调节血浆pH值，维持酸碱平衡值，维持酸碱平衡 vv运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等离子等 免疫作用免疫作用 vv肝炎：白蛋白、肝炎：白蛋白、a1-球蛋白、球蛋白、a2-球蛋白、球蛋白、-球蛋白下降，球蛋白下降，球蛋白升高球蛋白升高 肝硬化：白蛋肝硬化：白蛋白、白、a1-球蛋白、球蛋白、a2-球蛋白下降明显，球蛋白下降明显，球球蛋白极度升高蛋白极度升高 vv肾病综合症：白蛋白降低，肾病综合症：白蛋白降低，2和和球蛋白升球蛋白升高高 v临床检测：