聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白.ppt
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。的技术。电泳基本原理：电泳基本原理：COO-COO-COOH +H+H+Pr Pr Pr +OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PH纤维状纤维状影响电泳速度的因素：影响电泳速度的因素：v样品本身：带电量，分子大小，形状样品本身：带电量，分子大小，形状v电场强度：电压电场强度：电压v电泳介质的电泳介质的pHpH和离子强度和离子强度v电渗作用电渗作用按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳盘状电泳通常是盘状电泳通常是不连续系统，不连续系统，利用缓冲液离子成分、利用缓冲液离子成分、pHpH、凝胶孔径进行电泳，带电颗粒电泳时具有、凝胶孔径进行电泳，带电颗粒电泳时具有电荷效电荷效应、分子筛效应、应、分子筛效应、浓缩效应浓缩效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳分类聚丙烯酰胺凝胶电泳分类以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是胶是单体聚丙烯酰胺（单体聚丙烯酰胺（Acr)Acr)和和交联剂甲叉双丙烯交联剂甲叉双丙烯酰胺酰胺(Bis)(Bis)交联而成的，催化剂为交联而成的，催化剂为过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)，加速剂为四甲基乙二胺加速剂为四甲基乙二胺TEMEDTEMED,形成形成三维网状凝胶。三维网状凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAG）的）的聚合反应：聚合反应：缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、PHPH的不连续性：的不连续性：电极缓冲液通常为电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCLpH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。被压缩。1cm1cm厚样品层可以压缩厚样品层可以压缩0.250.25m m的厚度。的厚度。三大效应：三大效应：浓缩效应浓缩效应 成分成分pH值值孔径孔径电泳缓冲液电泳缓冲液甘氨酸甘氨酸(慢离子慢离子)8.3样品样品蛋白质蛋白质6.7浓缩胶浓缩胶Cl-(快离子快离子)6.7大大分离胶分离胶Cl-(快离子快离子)8.9小小有效迁移率有效迁移率=迁移率迁移率 解离度解离度分子筛效应：分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷量不同，迁移率不同。实验步骤实验步骤1.制备制备PAGEPAGE胶柱胶柱 画线，封口：在一端取画线，封口：在一端取7cm7cm和和7.5cm7.5cm两处画线，此两处画线，此 端管口插入橡皮垫。端管口插入橡皮垫。制备分离胶：配制好制备分离胶：配制好7.5%7.5%分离胶，缓慢注入玻璃管分离胶，缓慢注入玻璃管 7cm7cm处，加水防止氧化，室温下聚合处，加水防止氧化，室温下聚合 聚合聚合20-30min20-30min。制备浓缩胶：配制好制备浓缩胶：配制好3%3%浓缩胶。将胶上层水倾倒出浓缩胶。将胶上层水倾倒出 去，用滤纸吸干余水。加浓缩胶，封去，用滤纸吸干余水。加浓缩胶，封 水。室温下聚合水。室温下聚合20-30min20-30min。2.2.上样和电泳：上样和电泳：将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡胶管及上槽，除气泡,加样品液加样品液50l50l至浓缩胶面。至浓缩胶面。加电解液直至装满上电泳槽。电泳约加电解液直至装满上电泳槽。电泳约1.5hr1.5hr。3.3.染色，观察结果：染色，观察结果：将胶从玻璃管中取出，注意将胶从玻璃管中取出，注意不要弄断凝胶。凝胶考马斯亮蓝染色，然后脱色，不要弄断凝胶。凝胶考马斯亮蓝染色，然后脱色，脱色脱色至背景清晰至背景清晰。观察结果。观察结果。结果示意图：结果示意图：2 1清蛋白清蛋白1 1丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。2 2制胶时，要充分摇匀，加速剂制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMEDTEMED最后加。最后加。3 3注意观察实验现象：分界面，浓缩效应注意观察实验现象：分界面，浓缩效应.4.4.氨基黑染色氨基黑染色脱色脱色染液回收。染液回收。5 5固体胶切忌倒入水池。固体胶切忌倒入水池。注意事项：注意事项：
