《植物生物技术概论》ppt课件.ppt

为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益第二章第二章基因工程基因工程1园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益园艺植物生物工程研究所2为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益基因工程基因工程(gene engineering)(gene engineering)的概念的概念基因工程基因工程也叫基因操作、遗传工程，或也叫基因操作、遗传工程，或DNADNA重重组技术。是按人们的需要，用类似工程设计的方组技术。是按人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（法将不同来源的基因（DNADNA分子），在体外构建分子），在体外构建成杂种成杂种DNADNA分子，然后导入受体细胞，并在受体分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。细胞内复制、转录、表达的操作。优优点点：打打破破了了常常规规育育种种难难以以突突破破的的物物种种之之间间的的限限制。制。3园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益理论依据理论依据不同基因具有相同的物质基础不同基因具有相同的物质基础基因是可切割的基因是可切割的基因是可以转移的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代4园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益基因工程的基本过程它它所所涉涉及及的的过过程程可可用用“分分(合合成成)、切切、连连、转转、选选、鉴鉴”六六个字表示。个字表示。分分(合成合成)指指DNADNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。的制备，包括从生物体中分离或人工合成。切切即在体外将即在体外将DNADNA进行切割，使之片段化或线性化。进行切割，使之片段化或线性化。连连即即在在体体外外将将不不同同来来源源的的DNADNA分分子子重重新新连连接接起起来来，构构建建重重组组DNADNA分子。分子。转转即即将将重重组组连连接接的的DNADNA分分子子通通过过一一定定的的方方法法重重新新送送入入或或细细胞中进行扩增和表达。胞中进行扩增和表达。选选从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；鉴鉴就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定5园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益6基因克隆示意图基因克隆示意图基因克隆示意图基因克隆示意图园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益7第一节第一节 DNA DNA重组技术重组技术园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益一、一、DNADNA的结构与功能的结构与功能8园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益9脱氧核糖核苷酸分子由脱氧核糖、碱基和磷酸基团（base）组成。1.1.组成组成园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益10多多个个脱脱氧氧核核苷苷酸酸按按此此方方式式连连接接成成多多聚聚脱脱氧氧核核苷苷酸酸，其其一一端端为为游游离离的的5磷磷酸酸基基团团(5-P)，称称为为5端端，而而另另一一端端为为游游离离的的3羟羟基基(3-OH)，称为，称为3端。端。园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益ChargaffChargaff规则的内容规则的内容所有所有DNA：A=T、G=C，即，即A+G=T+C。DNA的的碱碱基基组组成成具具有有种种的的特特异异性性，即即不不同同种种的的DNA碱碱基组成不一样。基组成不一样。对对同同一一生生物物物物种种，DNA的的碱碱基基组组成成没没有有组组织织和和器器官官的的特异性特异性。DNA的的碱碱基基组组成成不不随随年年龄龄、营营养养状状况况及及环环境境的的改改变变而而改变。改变。11园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益2.2.结构结构（1 1）DNADNA的一级结构的一级结构脱脱氧氧核核苷苷酸酸在在长长链链上上的的排排列列顺顺序序就就是是DNADNA的的一级结构。一级结构。不不同同种种DNADNA之之间间的的千千差差万万别别只只是是在在碱碱基基排排列列顺序不同。顺序不同。DNADNA的的一一级级结结构构也也称称为为核核苷苷酸酸序序列列或或碱碱基基序序列列。12园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益（2 2）DNADNA的二级结构的二级结构DNA的二级结构即的二级结构即DNA双双螺旋结构模型螺旋结构模型(DNA Double Helix Model).13园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益141952.Kings Lab.UKM.H.F.Wilkins&Rosalind Frankin DNA的高质量的高质量 X射线衍射图射线衍射图园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益151953.Watson&Crick B-DNAB-DNA的右手双螺旋模型的右手双螺旋模型园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益16DNADNA双螺旋的结构特点双螺旋的结构特点 l两股单链两股单链糖糖-磷酸磷酸构成骨架，居双螺构成骨架，居双螺旋外侧。碱基位于双螺旋内侧，并与中心旋外侧。碱基位于双螺旋内侧，并与中心轴垂直。轴垂直。l每圈螺旋含每圈螺旋含1010个核苷酸残基，螺距：个核苷酸残基，螺距：3.4nm,3.4nm,直径直径:2nm:2nm。有两个沟：大沟和小。有两个沟：大沟和小沟。沟。l 碱基严格配对碱基严格配对:A:A与与T T、C C与与G G互补碱基与互补碱基与互补链互补链。l由两条反向平行的脱氧多核苷酸链由两条反向平行的脱氧多核苷酸链围绕同一中心轴构成右手双螺旋结构。围绕同一中心轴构成右手双螺旋结构。园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益17影响双螺旋结构稳定性的因素影响双螺旋结构稳定性的因素 氢键氢键(Hydrogen bond)弱键弱键,可加热解链可加热解链.磷酸酯键磷酸酯键(phosphoester bond),也叫也叫离子键离子键。强键强键,需酶促解链需酶促解链.碱基堆积力碱基堆积力(非特异性结合力非特异性结合力).磷酸骨架磷酸骨架,氨基氨基,酮基周围水分子间的有序排列酮基周围水分子间的有序排列 Van de waals force 疏水作用力疏水作用力(Hydrophobic interaction)园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益Z-DNAZ-DNAA-DNAB-DNADNADNA的分子构型（的分子构型（B/Z/AB/Z/A）比较）比较18为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益 由由于于双双链链DNADNA是是靠靠互互补补配配对对的的碱碱基基之之间间的的氢氢键键维维持持的的，因因此此当当溶溶解解在在溶溶液液中中的的双双链链 DNADNA处处于于较较高高温温度度条条件件下下时时，因因氢氢键键断断开开而而解解链链成成单单链链DNADNA，此此过过程程称称为为DNADNA变性变性。DNADNA溶溶液液加加热热到到9090时时，就就足足以以使使DNADNA完完全全变变性性。高高温温变变性性的的DNADNA被被逐逐渐渐冷冷却却时时，分分开开的的两两条条单单链链又又会会重新结合成双链重新结合成双链DNADNA，此过程称为，此过程称为复性复性。DNADNA的变性与复性的变性与复性19园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益20园艺植物生物工程研究所DNADNA的变性与复性的变性与复性为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益DNADNA分子杂交分子杂交21园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益双双螺螺旋旋DNA进进一一步步扭扭曲曲盘盘绕绕则则形形成成其其三三级级结结构构，超螺旋是超螺旋是DNA三级结构的主要形式。三级结构的主要形式。绝绝大大多多数数原原核核生生物物都都是是共共价价封封闭闭环环(covalently closed circle,CCC)分分子子，这这种种双双螺螺旋旋环环状状分分子子再再度螺旋化成为超螺旋结构度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或或supercoil)。超螺旋按其方向分为超螺旋按其方向分为正超螺旋正超螺旋和和负超螺旋负超螺旋两种。两种。22园艺植物生物工程研究所（3 3）DNADNA的三级结构的三级结构为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益23园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益（1 1）DNADNA分子能在细胞内复制分子能在细胞内复制以亲代以亲代DNADNA的一条单链为模板，按照碱基互补原则，的一条单链为模板，按照碱基互补原则，合成另一条具有互补碱基的新链。合成另一条具有互补碱基的新链。通过复制所形成的新通过复制所形成的新DNADNA子链，含有原来亲本子链，含有原来亲本DNADNA双链分子的一条亲代链和一双链分子的一条亲代链和一 条新的子代链，所以条新的子代链，所以DNADNA这种自我复制方式称为这种自我复制方式称为半保留复制半保留复制。园艺植物生物工程研究所243.DNA3.DNA的功能的功能为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益25园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益园艺植物生物工程研究所26DNADNA的的功功能能起起着着贮贮存存和和传传递递遗遗传传信信息息的作用。的作用。基基因因基基因因就就是是DNADNA的的功功能能片片断断，或或者者说说基因是一段基因是一段DNADNA顺序顺序。（2 2）贮存和传递遗传信息）贮存和传递遗传信息为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益DNADNA的的基基本本功功能能就就是是作作为为生生物物遗遗传传信信息息复复制制的的模模板板和和基基因因转转录录的的模模板板，是是生生命命遗遗传传繁繁殖殖的的物物质质基基础础，也也是是个个体体生命活动的基础。生命活动的基础。27园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益DNADNA体体外外重重组组，首首先先必必须须获获得得重重组组和和能能够够重重组的组的DNADNA片段。片段。如如何何获获得得DNADNA片片段段呢呢？28二、限制性内切酶与二、限制性内切酶与DNADNA片段化片段化园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益29一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans)，获获19781978年诺贝尔生理学年诺贝尔生理学和医学奖和医学奖园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益30园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益31限限制制性性内内切切酶酶(restriction(restriction endonuclease)endonuclease)是是指指一一类类能能识识别别双双链链DNADNA中中特特殊殊核核苷苷酸酸序序列列，并并在在合合适适反反应应条条件件下下使使每每一一条条链链一一定定位位点点上上的的磷磷酸酸二二酯酯键键断断开开，产产生生具具有有3-OH3-OH基团和基团和5-P5-P基团的基团的DNADNA片段。片段。内切核酸酶有内切核酸酶有型酶、型酶、型酶型酶和和型酶。型酶。1 1个个单单位位限限制制性性内内切切酶酶是是指指在在最最适适条条件件下下，在在50l50l体体积积1 1小时内完全切开小时内完全切开1g1g 噬菌体噬菌体DNADNA所需的酶量。所需的酶量。1.1.限制性内切酶限制性内切酶园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益32限制性内切酶的种类园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益（1 1）限制性核酸内切酶的命名）限制性核酸内切酶的命名一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株第四个字母表示菌株(品系品系)。前三个字母必须是斜体。前三个字母必须是斜体。例如，从例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切中提取的限制性内切酶称为酶称为Bam H。在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。等。EcoR(E：属名；：属名；co：种名；：种名；R：株；：株；：发现次序：发现次序)。EcoR I Escharichia coli Ry13 first33园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益（2 2）识别序列）识别序列限限制制性性内内切切酶酶可可特特异异地地结结合合于于一一段段被被称称为为限限制制酶酶识识别别序序列列的的DNADNA序序列列位位点点上上并并在在此此切切割割双双链链DNADNA。绝绝大大多多数数限限制制性性内内切切酶酶识识别别长长度度为为6 6个个核核苷苷酸酸的的特特异异序序列列，切切割割位位点点相相对对于于二二重重对对称称轴轴的的位位置置因因酶而异。酶而异。少少数数限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别序序列列由由4 4个个或或者者5 5个个核核苷苷酸对组成。酸对组成。34园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益35园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益（3 3）酶切位点）酶切位点36lDNADNA在在限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶的的作作用用下下，使使多多聚聚核核苷苷酸酸链链上上磷磷酸酸二二酯酯键键断断开开的的位位置置被被称称为为酶酶切切位位点点，可可用用表示。表示。l一一般般酶酶切切位位点点在在识识别别序序列列内内部部，如如GGATCCGGATCC；少数在识别序列两侧，如：少数在识别序列两侧，如：GATCGATC、CATGCATG等。等。l一一些些酶酶恰恰在在对对称称轴轴处处同同时时切切割割DNADNA双双链链而而产产生生带带平端的平端的DNADNA片段片段；l另另一一些些酶酶则则在在对对称称轴轴两两侧侧相相对对的的位位置置上上分分别别切切断断两两条条链链，产产生生带带有有单单链链突突出出端端（即即黏黏端端）的的DNADNA片片段段园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益平末端与黏性末端平末端与黏性末端37园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益38为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益39为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益反反应应只只需需Mg2+的的存存在在，并并且且具具有有以以下下两两个个特特点点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识识别别位位点点是是一一个个回回文文对对称称结结构构，并并且且切切割割位位点点也也在这一回文对称结构上。在这一回文对称结构上。许许多多型型酶酶切切割割DNA后后，可可在在DNA上上形形成成黏黏性性末端末端，有利于，有利于DNA片段的重组。片段的重组。II II型酶型酶40园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益类酶识别序列类酶识别序列特点特点41为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益 同同裂裂酶酶（isoschizomers)isoschizomers)：指指来来源源不不同同但但识识别别相相同同靶靶序序列列的的核核酸酸内内切切酶酶。同同裂裂酶酶进进行行同同样样的的切切割割，产产生生同同样样的的末末端端。但但有有些些同同裂裂酶酶对对甲甲基基化化位位点点的的敏感性不同。敏感性不同。Example:Example:限限制制酶酶HpaHpa和和MspMsp是是一一对对同同裂裂酶酶 （CCGG)CCGG)，当当靶靶序序列列中中一一个个5-5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶时时HpaHpa不能进行切割，而不能进行切割，而MspMsp可以。可以。同裂酶与同尾酶同裂酶与同尾酶42园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）43序序列列不不同同但但产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端的的核核酸酸内内切切酶酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益三、特异三、特异DNADNA片段的片段的PCRPCR扩增扩增PCR 技技术术(Polymerase Chain Reaction):是是在在模模板板DNA、引引物物和和四四种种dNTP 等等存存在在的的条条件件下下,依赖于依赖于DNA 聚合酶聚合酶(Taq 酶酶)的酶促合成反应。的酶促合成反应。其其具具体体反反应应分分三三步步:变变性性、退退火火、延延伸伸。以以上上三三步步为为一一个个循循环环,经经25 30次次循循环环DNA 数数量量可达可达210 6 7拷贝数。拷贝数。44园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益451983年年，美美国国PE-Cetus公公司司的的Mullis等等人人发发明明了聚合酶链反应（了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制复制最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶聚合酶进行进行PCR耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的应应用用使使得得PCR能能高高效效率率的的进进行行，随随后后PE-Cetus公公司司推推出出了了第第一一台台PCR自自动动化热循环仪化热循环仪1993年，年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖PCRPCR技术的发明技术的发明园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益46Kary B.Mullis 1989年年美美国国Science杂杂志志列列PCR 为为十十余余项项重重大大科科学学发发明明之之首首,比比喻喻1989年年为为PCR爆爆炸炸年年,Mullis荣获荣获1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益PCRPCR技术的反应条件技术的反应条件 标准的标准的PCR反应体系反应体系4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物引物 各各10100pmol模板模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L47园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益(c)(b)引物引物2533355(d)新引物新引物53靶靶DNA的扩增的扩增(a)53引物引物13 535引物引物2互补链互补链引物引物1互补链互补链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链5335引物引物1互补链互补链引物引物2互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)48为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益园艺植物生物工程研究所园艺植物生物工程研究所49温度温度（）时间时间（min）94726094变性变性（1min）60 退火退火（1min）72 延伸延伸（1.5min）循环循环1 循环循环2 循环循环3PCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94变性变性1min，60 退火退火1min，72 延伸延伸1.5min。为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益反反应应初初期期，目目的的DNADNA片片段段呈呈指指数数形形式式增增加加；随随着着目目的的DNADNA的的积积累累，在在引引物物、模模板板与与DNADNA聚聚合合酶酶达达到到一一定定比比例例时时，酶酶的的催催化化反反应应趋趋于于饱饱和和平平台台期期（2525个个循循环环）。50园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益1.1.双链双链DNADNA变性变性51（一）（一）PCRPCR的反应过程的反应过程园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益522.2.引物与模板引物与模板DNADNA退火退火园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益533.3.引物延伸引物延伸 DNADNA合成合成园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益544.4.第二轮循环的变性第二轮循环的变性园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益555.5.第二轮循环的引物延伸第二轮循环的引物延伸 DNADNA合成合成园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益56园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益57PCR反应的特点特异性强特异性强灵敏度高：灵敏度高：PCRPCR产物的生成量是以产物的生成量是以指数方式增加指数方式增加的，能将的，能将皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级的起始待测模板扩增到微克量级的起始待测模板扩增到微克(m mg=10g=10-6-6)水平水平简便、快速：简便、快速：PCRPCR反应一般在反应一般在2 24 4 小时小时完成扩增反应。扩完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。易推广。对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA DNA 粗制品及总粗制品及总RNARNA均可作为扩增模板。均可作为扩增模板。园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益58（二）（二）RT-PCR（reverse transcription PCR）u反转录反转录PCRPCR是一种从是一种从RNARNA扩增扩增cDNAcDNA的方法。的方法。u提提取取组组织织或或细细胞胞中中的的总总RNARNA，以以其其中中的的mRNAmRNA作作为为模模板板，采采用用Oligo(dT)Oligo(dT)或或随随机机引引物物利利用用逆逆转转录录酶酶反反转转录录成成cDNAcDNA；再再以以cDNAcDNA为为模模板板进进行行PCRPCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。扩增，而获得目的基因或检测基因表达。园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益59为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益60四四 DNADNA片段的化学合成片段的化学合成利用利用DNADNA合成仪，根据待合成的合成仪，根据待合成的DNADNA片段预定的片段预定的核苷酸序列，可自动的将核苷酸序列，可自动的将4 4种核苷酸单体按种核苷酸单体按3-53-5磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。合成引物合成引物合成合成DNADNA寡核苷酸连杆寡核苷酸连杆(linker)(linker)合成基因片段合成基因片段园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益寡核苷酸连杆也也称称为为衔衔接接物物或或接接头头，是是一一种种按按预预先先设设计计，化化学学合合成成的的寡寡核核苷酸片段。苷酸片段。有有一一种种或或几几种种限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶的的识识别别序序列列，使使连连接接了了寡寡核核苷苷酸酸连连杆杆的的DNADNA片片段段经经过过这这些些限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶酶酶切切后后，可可以以产产生生一一定定的的黏黏性性末末端端，便便于于与与具具有有相相同同黏黏性性末末端端的的另另一一DNADNA片段连接。片段连接。61园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益有有的的寡寡核核苷苷酸酸连连杆杆超超过过100100个个核核苷苷酸酸，其其上上有有多多种种限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶识识别别序序列列，不不仅仅可可作作为为连连杆杆，而而且且被被组组装装在在克克隆隆载载体体上上成成为为多多克克隆隆位位点点(MCS)(MCS)。这这样样的的连连杆杆被被称称为为多多克克隆隆位位点点核核苷苷酸酸连连杆杆或或简简称称MCSMCS连杆连杆。62园艺植物生物工程研究所MCS连杆连杆为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益五五 DNADNA片段的连接重组片段的连接重组DNA连连接接酶酶(DNA ligase)能能催催化化双双链链DNA片片段段紧紧靠靠在在一一起起的的3-OH末末端端和和5-P末末端端之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，使使两两末末端连接。端连接。目目前前用用于于试试管管中中连连接接DNA片片段段的的DNA连连接接酶酶E.coli DNA连连接酶接酶和和T4 DNA连接酶连接酶。E.coli DNA连连接接酶酶只只能能催催化化双双链链DNA片片段段互互补补黏黏性性末末端端之之间的连接；间的连接；而而T4 DNA连连接接酶酶既既可可用用于于双双链链DNA片片段段互互补补黏黏性性末末端端之之间的连接，间的连接，也能也能催化双链催化双链DNA片段平末端之间的连接片段平末端之间的连接。园艺植物生物工程研究所631.DNA连接酶连接酶为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益64 DNA DNA连接酶只能连接缺口（连接酶只能连接缺口（nicknick），不能连接裂口（），不能连接裂口（gapgap）。）。而且被连接的而且被连接的DNADNA链必须是双螺旋链必须是双螺旋DNADNA分子的一部分。分子的一部分。园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益DNA连连接接酶酶利利用用NAD或或ATP中中的的能能量量催催化化两两个个核核酸链之间形成磷酸二酯键。酸链之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶连接酶 NAD+T4 DNA连接酶连接酶 ATP65为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益（1）具互补黏性末端片段之间的连接）具互补黏性末端片段之间的连接连接反应连接反应可用可用E.coli DNA连接酶连接酶，也可用也可用T4 DNA连接酶连接酶；待待连连接接的的两两个个DNA片片段段的的末末端端如如果果是是用用同同一一种种限限制制性性内内切切核核酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。酸酶酶切的，连接后仍保留原限制性内切核酸酶的识别序列。如如果果是是用用两两种种同同尾尾酶酶酶酶切切的的，虽虽然然产产生生相相同同的的互互补补黏黏性性末末端端，可可以以有有效效地地进进行行连连接接，但但是是获获得得的的重重组组DNA分分子子往往往往消消失失了了原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列原来用于酶切的那两种限制性内切核酸酶的识别序列。662.DNA2.DNA片段之间的连接片段之间的连接园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGDNA连接酶连接酶GATCC GGCCTAG+重组体重组体目的基因自连目的基因自连 载体自连载体自连2.DNA2.DNA片段之间的连接片段之间的连接（1 1）具互补黏性末端片段之间的连接）具互补黏性末端片段之间的连接为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连（2）具平末端）具平末端DNA片段之间的连接片段之间的连接为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益采用核酸外切酶将黏性末端修饰成平末端；采用核酸外切酶将黏性末端修饰成平末端；采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）采用末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）将平末端修饰成互补黏性末端。将平末端修饰成互补黏性末端。69（3）DNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益人工合成的人工合成的连杆连杆或或衔接头衔接头先先将将连连杆杆连连接接到到待待连连接接的的一一种种或或两两种种DNA DNA 片片段段的的末末端端，然然后后用用合合适适的的限限制制性性内内切切核核酸酸酶酶酶酶切切连连杆杆，使使待待连连接接的的两两种种DNADNA片片段段具具互互补补黏黏性性末末端端，最最后后在在DNADNA连连接接酶酶催催化化下下使使两两种种DNADNA片片段段连连接接，产生重组产生重组DNA DNA 分子。分子。70（4）DNA 片段加连杆后连接片段加连杆后连接园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益71衔接物连接法园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益3.DNA3.DNA重组类型重组类型DNA重重组组实实际际上上是是两两种种DNA片片段段的的连连接接，若若待待连连接接的的两两种种DNA片片段段各各含含有有一一个个以以上上的的基基因因，这这样样的的DNA重组也称为重组也称为基因重组基因重组。DNA 重组分为重组分为插入重组插入重组和和置换重组置换重组。72园艺植物生物工程研究所为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合