1赶黄草总黄酮对肾病综合征大鼠的保护作用（孔维红）.doc

中 南 大 学 网 络 教 育毕 业 论 文论文题目赶黄草总黄酮对肾病综合征大鼠的保护作用 姓 名 孔维红 学 号 17134020701123 专 业 药剂学 层 次 专升本 学习中心重庆学习中心 指导教师 朱仝飞 2019年 9 月 14 日中南大学网络教育毕业论文（设计）目 录摘要11引言22材料与方法22.1材料22.2方法32.2.1动物分组、造模及给药32.2.2检测样本收集32.2.3检测指标32.2.4数据统计33结果与讨论43.1造模药物剂量及动物初始体重选择43.2一般状态观察43.3各组大鼠死亡情况42.5各组大鼠血清生化指标62.6大鼠24h尿蛋白测定74结论7参考文献8致谢9摘要目的：为研究赶黄草总黄酮对阿霉素肾病综合征模型大鼠的保护作用。方法： 文以赶黄草总黄酮为原料，通过阿霉素诱导大鼠建立肾病综合征模型。以24h尿蛋白定量、体质量、各脏器指数、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、总蛋白（TP）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）含量以及肾组织病理变化等为检测指标，探索赶黄草总黄酮对肾病综合征大鼠的影响。结果：阿霉素造模总剂量为5mg/kg，分别于第1d和第8d给药，21d即造模成功。药物干预4w后，同模型组相比,赶黄草总黄酮高剂量组大鼠TP增加了9.86%，TC降低了36.98%，TG降低了30.77%，大鼠24h尿蛋白量水平降低了70.84%。总黄酮低剂量组TP增加了11.86%，TG降低了19.79%，大鼠24h尿蛋白量水平降低了57.98%，肾脏纤维化和损伤均有明显改善。结论： 赶黄草总黄酮能够调节肾病综合征模型大鼠体内脂质代谢，改善肾脏对蛋白的滤过，对肾病综合征大鼠肾损伤具有一定的保护作用。关键词：赶黄草；总黄酮；肾病综合征；阿霉素1引言慢性肾脏病（CKD）是严重危害人类健康的常见疾病，世界上约11%的人患有该病，它是导致人类死亡的十大疾病之一。肾病综合征是CKD临床诊断的常见类型，占肾活检病例的40%左右。肾病综合SH征（nephrotic syndrome，NS）是由感染、遗传、免疫等原因导致肾小球滤过膜损伤，肾小球基膜通透性增加的一种病理生理状态，其临床典型的症状为大量蛋白尿（大于3.5g/24h）、低蛋白血症（小于30g/L）、高度水肿及高脂血症。肾病综合征若得不到有效控制，将导致肾组织进行性纤维化，继而逐渐发展至终末期肾病。赶黄草是虎耳草科扯根菜属植物扯根菜 Penthorum chinense pursh.的干燥地上部分，为苗族民间草药，主产于四川、贵州、湖南等地，为四川泸州古蔺道地药材。赶黄草性平、味苦、微辛、无毒、归肝、肾经。具有清热解毒、退黄化湿、活血散瘀、利水消肿之功效，主治黄疸、经闭、水肿、跌打损伤等。赶黄草归肝经，对肝病具有治疗作用，赶黄草在苗族民间有上千年的用药史，为苗族人民治疗肝病，发挥出了独特疗效，被誉为“神仙草”。现代临床也广泛用于治疗各型肝炎、胆囊炎、脂肪肝等。高度水肿是肾病综合征临床典型表现之一，赶黄草归肾经，主治水肿，而黄酮类化合物是赶黄草的主要化学成分，也是其功效成分，因此我们认为赶黄草总黄酮可能具有治疗肾病综合征的作用。前期我们已制备了含量超过50%的赶黄草总黄酮，本试验通过建立肾病综合征大鼠模型，研究赶黄草总黄酮对肾病综合征大鼠的作用，为赶黄草总黄酮进一步研发和临床治疗肾病综合征奠定基础。2材料与方法2.1材料雄性SD大鼠，无特定病原体（SPF级），体重在160200g左右，西南医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2018-17；注射用盐酸阿霉素（ADR），山西普德药业股份有限公司（批号02180802）；醋酸泼尼松片5mg/片，浙江仙琚制药股份有限公司（批号170244）；赶黄草总黄酮（总黄酮含量为53.29%）；脑脊液与尿蛋白（CSF）测定试剂盒（终点法），北京利德曼生化股份有限公司（生产许可证号20000439）。Infinite 200 Pro酶标仪，上海吉盛医学科技有限公司；Konelab prime 30，Thermo scientific生化自动分析仪，芬兰；CX40系列生物显微镜，宁波舜宇仪器有限公司。2.2方法2.2.1动物分组、造模及给药取雄性SD大鼠60只，8只作为空白对照组，其余52只随机分成4组，分别为模型组、醋酸泼尼松组及赶黄草总黄酮高、低剂量组，饲养一段时间，待体重达到250g以上放入清洁代谢笼中，禁食不禁水，收集24h尿液，将阿霉素用生理盐水配成2mg/mL溶液。造模第1d和第8d除空白组外其余4组尾静脉（iv）分别给予4mg/kg和1mg/kg剂量的阿霉素，空白对照组尾iv等体积的生理盐水。隔一周收集一次24h尿液，送西南医科大学附属医院检验科测定尿蛋白含量，当24h尿蛋白含量达到100mg以上即表明肾病模型造模成功，模型制备成功后开始药物干预，醋酸泼尼松组大鼠每天按剂量6mg/kg灌胃醋酸泼尼松1次，赶黄草总黄酮的成人剂量为0.0160.032g/(kg.d），按成人与大鼠用药量换算方法，则高、低剂量组分别给予赶黄草总黄酮0.2g/(kg.d）、0.1g/(kg.d），空白对照组和模型组灌胃（ig）等量生理盐水。药物干预4weeks，期间自由饮食。2.2.2检测样本收集分别于造模第0、7、14、21、35、49d将大鼠置于代谢笼中24h，收集尿液并记录尿液体积，3000r/min离心15min，测尿量白蛋白，观察大鼠行为状态，如采食、饮水、排泄、毛发、有无水肿等，并记录体重、死亡量。大鼠禁食24h后于第29d乙醚麻醉，心脏采血，将血样静置2h，3000r/min离心5min，取上清，即得血清。2.2.3检测指标1）尿蛋白定量测定将0.1mL离心后的尿液加入提前混合好的检测试剂，37水浴孵育半小时取出，冷却，用酶标仪测定吸光度值，检测波长562nm，计算蛋白浓度。24h尿蛋白排泄量即为蛋白浓度乘以24h尿液总体积（mL）。2）血清生化指标测定使用生化测定仪（Konelabprime30，Thermoscientific，芬兰）分析血清ALB、TP、TG、TC、BUN、Scr。3）病理组织分析取肝、心、脾、肺、肾称重，将肾组织固定。用蒸馏水冲洗固定液，依次用15%、35%、55%、75%、95%、100%酒精脱水后，二甲苯透化，石蜡浸泡一段时间后包埋；切成35m厚的切片，于60温度下将切片中石蜡烤化。分别进行HE染色和Masson染色，透明及封片后进行光镜检查。2.2.4数据统计使用SPSS16.0软件进行统计处理试验数据，结果用±s表示，采用方差分析进行多组均数比较，两两均数比较则采用q检验，若p<0.05，则表明差异具有统计学意义。3结果与讨论3.1造模药物剂量及动物初始体重选择阿霉素又名多柔比星，为广谱抗肿瘤药物，具有一定的细胞毒性，阿霉素可较好制备与人类相似的肾病综合征模型，因此本文选用阿霉素复制稳定的肾病综合征模型。包玉龙等7考察了不同剂量的阿霉素对大鼠死亡率的影响，发现阿霉素剂量跟大鼠的死亡率有相关性，李爱平等对阿霉素的造模剂量以及大鼠造模起始体质量进行了考察，确定了肾病综合征大鼠模型的造模剂量：阿霉素累计剂量为5mg/kg,分两次给药，第一天尾iv注射4mg/kg,隔一周注射1mg/kg。对于大鼠造模起始体质量的选择，发现起始体质量约300g的大鼠对阿霉素具有较强的反应，因此本试验初期对体质量为150200g和250300g大鼠造模后21d内的死亡率进行了比较，发现体重为150200g的大鼠死亡率为30.77%，高于体质量为250300g的大鼠的死亡率，因此最终选择阿霉素(4+1)mg/kg的剂量，起始体质量达到250g以上的大鼠制备肾病综合征模型。3.2一般状态观察造模过程中，空白组喜饮食，大便正常成形，毛发光泽不易脱落，活泼好动。其他组造模后大鼠饮食量明显偏少，嗜睡，活动量少，尿量偏少，毛发凌乱无光泽，大便偏稀颜色偏黑不成形，少数几只出现鼻孔眼睛出血现象。由于尾静脉注射阿霉素操作不当，造成阿霉素泄露，10只大鼠出现烂尾现象。造模第10d开始除正常对照组外各组均出现死亡现象，造模14d后，除正常对照组外，其他组大鼠均出现四肢、口鼻、阴囊红肿，行走困难等现象。给药4w，模型组大鼠状态无明显改善，醋酸泼尼松组和赶黄草总黄酮高、低治疗组大鼠饮食、活动量、四肢阴囊红肿、尿量、体重均有明显好转。3.3各组大鼠死亡情况除正常组外，造模及给药期间其他各组共有6只老鼠死亡，解剖后均出现肠胀气现象，模型组死亡3只，1只解剖后发现肝脏有多数白色颗粒状小点，2只右肾偏白，醋酸泼尼松组、赶黄草总黄酮高低剂量组各1只，解剖后均发现其中一只肾脏偏白。模型组死亡率达23.08%，略高于李爱平等研究中模型组的死亡率（13.33%），可能是造模给药时推注速度过快以及阿霉素泄露于皮下和皮肤导致大面积烂尾所致，具体死亡数见表1。组别死亡数/总动物数总死亡率（%）0天7天14天21天35天49天空白对照组0/80/80/80/80/80/80模型组0/130/131/131/133/133/1323.08%醋酸泼尼松组0/130/131/131/131/131/137.69%赶黄草总黄酮高剂量组0/130/131/131/131/131/137.69%赶黄草总黄酮低剂量组0/130/130/131/131/131/137.69%表1各组大鼠死亡情况2.4体质量及各脏器指数由表2可知，将大鼠适应性喂养2w后，体质量达250g以上即开始造模，空白组大鼠体质量增加了51.76%，从造模第0d开始到第14d，除空白组外其他组大鼠体重均呈下降趋势，下降率分别为3.16%、3.61%、2.86%、4.33%，此时，空白组大鼠体质量与模型组、赶黄草总黄酮高低剂量治疗组相比具显著性差异。14d后体质量开始缓慢增长，造模21d后给予不同药物干预，第21d到35d，模型组、醋酸泼尼松组、赶黄草总黄酮高低剂量组大鼠体质量均有显著性改善，增长率分别为5.44%、14.42%、13.47%、8.01%，但与空白组相比仍存在显著性差异，且醋酸泼尼松组、总黄酮高剂量组两组增长速度明显高于模型组和总黄酮低剂量组，35d到49d，模型组体质量上升至310.14g，各药物治疗组体质量基本保持不变，结果显示给予赶黄草总黄酮干预后，肾病综合征大鼠的体质量得到明显改善。由表3可知，与空白组相比其他各组大鼠的肝脏左肾右肾指数；模型组大鼠脾脏指数以及总黄酮低剂量组大鼠肺脏指数均存在显著性差异（p<0.01）。说明高剂量赶黄草总黄酮可明显回调大鼠的肝脏、脾脏、左肾和右肾指数。表2各组大鼠体重变化时间/d体重/g空白对照组模型组醋酸泼尼松组赶黄草总黄酮高剂量组赶黄草总黄酮低剂量组0252.94±6.89273.01±4.37274.95±3.99269.48±5.59271.93±4.577265.95±11.24261.00±5.38260.77±6.38260.05±5.96263.27±5.5614283.92±6.94264.38±8.17265.01±11.21261.78±5.35260.15±7.0021307.50±13.39271.83±15.36275.86±13.89278.95±6.12278.77±10.0935366.16±14.48286.62±23.8315.65±13.5316.53±10.6301.11±10.7449383.86±42.29310.14±21.43313.55±17.59316.14±10.84301.83±10.04表3大鼠各脏器指数组别脏器指数×100空白对照组模型组醋酸泼尼松组赶黄草总黄酮高剂量组赶黄草总黄酮低剂量组肝2.28±0.123.09±0.122.93±0.192.77±0.092.83±0.15心0.29±0.010.34±0.020.33±0.010.33±0.010.31±0.01脾0.13±0.0030.20±0.0210.16±0.0060.15±0.0070.18±0.009肺0.43±0.0180.46±0.0090.47±0.0200.48±0.0210.49±0.014左肾0.30±0.0060.36±0.0130.33±0.0090.34±0.0080.34±0.011右肾0.30±0.0090.36±0.0080.33±0.0110.34±0.0050.34±0.0112.5各组大鼠血清生化指标由表4可知，与空白组相比，模型组大鼠TC、TG、BUN水平分别增加76.15%、105.26%、28.83%，ALB、TP水平分别降低13.25%、15.02%，与宁华英等研究结果相似；总黄酮低剂量组大鼠的TC水平显著升高；与模型组相比，醋酸泼尼松组、赶黄草总黄酮高剂量组大鼠TC水平分别降低32.81%、36.98%；醋酸泼尼松组、总黄酮高低剂量组大鼠TP水平增加了10.02%、9.85%、11.86%，TG水平降低34.61%、30.77%、37.18%，均具有显著性差异（p<0.01），说明醋酸泼尼松和赶黄草总黄酮高剂量组均可改善肾病综合征大鼠血清中TP、TC、TG水平，赶黄草总黄酮低剂量组可改善TP和TG水平。说明赶黄草总黄酮可下调肾病综合征模型大鼠的总胆固醇和甘油三酯水平，上调总蛋白。表4各组大鼠血清生化指标生化指标空白对照组模型组醋酸泼尼松组赶黄草总黄酮高剂量组赶黄草总黄酮低剂量组TP/(g/L)71.62±2.1760.86±1.7366.96±1.6166.86±2.3668.08±2.17TC/(mmol/L)1.09±0.101.92±0.161.29±0.221.21±0.101.54±0.12TG/(mmol/L)0.38±0.030.78±0.070.51±0.060.54±0.050.49±0.04ALB/(g/L)35.62±1.8730.90±0.6533.09±1.2132.59±2.0935.17±1.39BUN/(mmol/L)*4.89±0.296.30±0.485.82±0.405.63±0.225.86±0.38Scr/(µmol/L)33.01±1.3732.48±1.9031.11±1.8531.74±2.2531.70±1.222.6大鼠24h尿蛋白测定肾病综合征可由多种不同病理类型的肾小球病变引起，尿蛋白量的高低可较准确反映肾小球功能。由表5可见，造模给药14d，与空白对照组大鼠相比，各组大鼠尿蛋白水平显著升高，具统计学意义(p<0.01),造模第21d，模型大鼠24h尿蛋白量达到106.23mg，超过100mg,表明肾病综合征大鼠模型制备成功，故从造模第21d后给予不同药物干预，药物干预后，与模型组相比，醋酸泼尼松组、赶黄草总黄酮高低剂量组尿蛋白水平分别降低123.34mg、97.95mg、80.17mg。结果表明，赶黄草总黄酮高低剂量均可不同程度降低肾病综合征大鼠尿蛋白量水平。时间/d体重/g空白对照组模型组醋酸泼尼松组赶黄草总黄酮高剂量组赶黄草总黄酮低剂量组08.75±3.968.90±3.628.75±4.009.03±4.279.00±3.28710.00±1.9810.79±2.65 11.69±1.949.68±3.2111.03±2.751411.38±1.0831.16±3.0729.65±4.2234.06±3.9228.79±3.672111.96±4.91106.23±6.49 112.71±7.13 104.94±4.52109.26±5.86359.18±8.31149.20±6.5626.41±5.2364.27±10.0164.70±8.14 4910.98±8.10 138.26±10.8614.92±9.9140.31±15.9758.09±18.93表5各组大鼠24h尿蛋白定量4结论 肾病综合征临床上常规使用激素治疗，短期见效快，但长期使用给患者带来一系列毒副作用。中医学认为肾病应归属于“水肿”、“癃闭”、“尿浊”、“虚劳”、“腰痛”之列，大量研究显示中药在治疗该病方面有独特的辨证论治优势，对缓解肾脏损伤，降低蛋白尿，减少并发症具有重要的治疗意义。研究者卢芙蓉用葫芦巴，焦志娜用黄芪，钟瑜用鱼腥草证明分别在尿蛋白，T淋巴细胞的双向调节功能，血胆固醇，总蛋白等指标上有明显的改善。进来有研究显示赶黄草提取液能降低大鼠尿蛋白水平，具有在高糖环境下保护肾脏功能的作用，为赶黄草总黄酮治疗肾病综合征提供了理论和实践基础。该研究得出赶黄草总黄酮高低剂量均可降低肾病综合征大鼠TC、TG水平，高剂量总黄酮可升高TP水平，赶黄草总黄酮高低剂量均可降低肾病综合征大鼠24h尿蛋白量且不同程度的保护肾脏细胞和降低肾脏纤维化。以赶黄草归肾经，主治水肿展开赶黄草对各种肾脏疾病的研究，为赶黄草用于临床治疗肾病综合征提供基础。参考文献1屈晓宇,高秋玉,邓小宽,高平.赶黄草总黄酮树脂精制工艺与检测方法J.基因组学与应用生物学,2019,38(05):2230-2237.2白雪. 赶黄草总黄酮的制备及其治疗肾病综合征大鼠的研究D.西南医科大学,2019.3雷斯瑀,肖霜艳,叶芮伶,廖树森,安楠,谭敏,朱满,刘中花,刘娟.赶黄草总黄酮的提取及其对小鼠酒精性肝损伤的治疗作用J.吉林畜牧兽医,2018,39(06):5-8+11.4覃俊媛,李梦婷,杨雪,陶美玲,赵君,陈秋伶,谢晓芳,彭成.赶黄草总黄酮对非酒精性脂肪肝小鼠肝功能和脂质代谢的影响J.成都中医药大学学报,2017,40(04):33-36.5余付香,陈明旭,成桥,陈韬,付亮,丁春邦.赶黄草总黄酮分级萃取及活性分析J.天然产物研究与开发,2017,29(06):976-982.6杨彦哲,张红,张丹,税丕先,刘明华.赶黄草总黄酮缓解体力疲劳的作用研究J.中国医院药学杂志,2017,37(05):430-434.7石晓,卓菊.赶黄草总黄酮抗大鼠酒精性肝纤维化作用的实验研究J.中药材,2015,38(07):1485-1487.8舒刚,张露,赵谨,郑艺蕾,古小云,汪开毓.赶黄草总黄酮对小鼠肝损伤的保护作用J.河南农业科学,2015,44(06):142-146.9徐秀泉,虞倩,徐颖,许慧敏.赶黄草总黄酮超声提取工艺的响应面法优化及其体外抗氧化活性分析J.中国实验方剂学杂志,2012,18(18):38-41.10李翠萍.赶黄草超微粉与粗颗粒总黄酮溶出率比较J.食品与发酵科技,2012,48(03):68-70.11余昕,朱烨,向芬,税丕先.不同采收期赶黄草中总黄酮的含量测定J.泸州医学院学报,2010,33(04):370-372.12何颖,朱烨,税丕先.赶黄草超微粉与粗粉总黄酮溶出率比较J.云南中医中药杂志,2009,30(09):55-56+4.致谢对于本次论文的写作首先我要感谢我的老师，在我对于论文感到迷茫的时候，是我的老师耐心的为我讲解论文写作的过程，积极的引导我如何思考并发现问题，如何切实有效的解决问题。 其次感谢中南大学给了我一个良好的学习平台，在这里让我接触到专业的经济学知识、管理理论以及相关的方方面面。在众多的老师的教导下，让我进一步的深化认识，打开思路，将所学所想融会贯通，把学到的知识切实的落实到实践中去，将知识转化成生产力。不仅如此，在这样一个平台上，还让我结识了众多志同道合的同学，我们彼此交流，相互促进，思想在碰撞中擦出绚丽的光华，让我们所接触的知识在讨论和模拟运用中得到升华。最后感谢在我写作期间帮助我的同事和领导，谢谢你们为我提出的中肯的意见和建议。总之，感谢在这段学习期间在我身边帮助过我的每个人，你们的鼓励是我继续前进的动力。感谢你们在我春风得意时的及时提醒，也感谢你们在我意志消沉时候的每一次激励。感谢有你们同在!11