遗传与分子生物学实验 (12).pdf
遗传与分子生物学实验（B B模模块块-基因克隆与表达自主实验）向指导教师及助教咨询。上课时你将亲自操作，完成相应实验内容。遇到实际问题，请不再讲述实验原理及实验步骤，可能会有小测检验预习情况。不再讲述实验原理及实验步骤，可能会有小测检验预习情况。完成预习报告(助教课上检查，占每次实验课成绩的50%)。课上课上公告：公告：请在课前结合课件、相关资料及慕课视频认真自学，并第五周 外源DNA在大肠杆菌中的高效表达第四周 感受态细胞的制备与DNA的转化第三周 质粒DNA片段的胶回收与连接第二周第二周 质粒质粒DNA的酶切及的酶切及DNA片段从凝胶中分离片段从凝胶中分离第一周 质粒DNA提取与浓度检测目的基因目的基因 载体载体 体外连接体外连接重组子（杂合重组子（杂合DNADNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNADNA基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线目的基因在原核细胞中目的基因在原核细胞中表达表达 提取质粒提取质粒DNA+酶切酶切遗传与分子生物学实验（B B模模块块-基因克隆与表达自主实验）第第二二周周 质质粒粒DNA的的酶酶切切及及DNA片片段段从从凝凝胶胶中中分分离离【实验目的】【实验目的】1.掌握DNA酶切酶切的注意事项及实验操作步骤；2.复习DNA琼脂糖凝胶电泳的实验操作步骤（配胶+上样+电泳+拍照）；3.掌握将将DNA片段从琼脂糖凝胶中切出片段从琼脂糖凝胶中切出的实验操作步骤。【实验原理】【实验原理】n限制性内切酶限制性内切酶是细菌中一类能识别双链DNA特定碱基顺序的核酸水解酶，类似免疫系统，抗击外来DNA侵袭。n以内切的方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端带磷酸基团，3端为-OH。n分类:依据识别切割特性、催化条件、是否有修饰酶活性n至2005年1月，共发现限制性内切酶3681种 型59种(识别特异，切割不特异）型3612种(识别特异特异，切割特异特异）型10种(识别特异，切割不特异）n商业化的限制性内切酶有 588 种。EcoRInII型限制性内切酶n即通常指的DNA限制性内切酶，占90%以上，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段；n分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子；n识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序；n切割双链DNA产生3种不同的切口：5端突出，3端突出和平末端。平末端粘性末端（5突出）粘性末端（3突出）酶切注意事项酶切注意事项-1n内切酶的选择和使用内切酶的选择和使用n根据模板DNA序列选用合适的内切酶来酶切，优先选择酶切后能形成粘性末端的内切酶。如果采用双酶切，先要注意两个酶切位点之间有足够的间隔序列，以确保两个酶都有足够的作用空间，还需注意两种酶有共同适宜的酶切反应缓冲液。n内切酶用量用量：根据内切酶单位和DNA用量而定，通常 1U（unit,单位）指在适当条件下，1小时内完全酶解g特定DNA底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以g DNA用2-3U酶短时间酶切为宜。n内切酶体积体积不能超过反应体系10，因内切酶中含50甘油，体系中甘油超过5会抑制内切酶活力，可能产生星号活性。酶切注意事项酶切注意事项-2n内切酶的选择和使用内切酶的选择和使用n正确使用和保存内切酶。l酶需要保存在-20度的低温环境中，只有在需要用酶时才从在需要用酶时才从冰箱中取出来冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶置于冰上，手拿酶管时不要接触酶管下部含酶的部分。l吸取酶时尽可能用长移液枪头,防止操作中引入其它内切酶或外切酶的污染。l由于酶液含有50%甘油，比较粘稠，应采用反向移液方法移液（吸液时移液器按钮按到第二档吸液，释放按钮；放液时，按到第一档打出液体，将液体排出）可减少喷溅、泡沫和气泡形成。并注意慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度，因为吸液速度过快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。l用完后需要及时送回冰箱存放原处。注意：酶要最后加。n模板模板DNA的纯度的纯度nDNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、高盐浓度等，它们均不同程度影响限制性内切酶的活力。可通过以下方法来克服：增加酶作用单位数（1015U/g DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂、或延长反应时间。n酶切反应条件酶切反应条件n反应缓冲液反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成3种级别的离子强度：低盐(10mM NaCl)、中盐（50mM NaCl）、高盐(100mM NaCl)。不同的内切酶有特定的最适反应缓冲液。如果采用双酶切，需注意采用两种酶共同适宜的反应缓冲液。酶切注意事项酶切注意事项-3n酶切反应体积酶切反应体积需要根据实验目的来定，注意DNA模板用量、酶用量和反应体积的关系。n酶切反应温度酶切反应温度一般选择37度，但少数酶，如Sma I的最适合作用温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。n酶切反应时间酶切反应时间:完全酶切可以用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理。在使用高酶量的时候需要注意，内切酶的总体积不应超过酶切总反应体积的10%（酶保存在50%的甘油中，当反应中甘油的终浓度超过5%时会引起酶的星号反应）。如采用60l的反应体系，酶的总用量不能超过6l。n加完酶切反应各组分后，要用移液枪头小心混匀几次，快速离心一下就可以保温了，一般不使用振荡器混匀。酶切注意事项酶切注意事项-4从凝胶中分离回收从凝胶中分离回收DNA片段片段n将将DNA片段从凝胶中切出后的回收方法片段从凝胶中切出后的回收方法：n电洗脱法(透析袋中进行,经济节省,回收效率高)n低熔点(65C)琼脂糖凝胶法nDEAE纤维膜插片法n玻璃奶法（在高盐状态下，氧化硅周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷与硅颗粒特异结合）n柱式柱式DNA胶回收法胶回收法(操作方便,快捷,纯度高)本实验本实验n应用应用：在生物技术实验中，PCR反应获得的目的片段、酶切后所得特定DNA序列、分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳将目的片段与其它DNA分开，再通过一定方法将目的DNA从凝胶中分离出来，得到纯化的目的DNA，以用于后续实验(如，分子杂交、重组子构建、序列分析等)。n柱式柱式DNA胶回收试剂盒胶回收试剂盒优点优点:快速，半小时可完成全过程；不使用苯酚/氯仿，更安全；获得DNA片段纯度高，可用于酶切、连接反应、测序；用途广，可用于DNA的浓缩、去盐及去除杂质（如引物，未标记上的核苷酸以及小的DNA片段）。吸附柱工作原理：吸附柱工作原理：高盐、低高盐、低pH值值条件下，硅基材料吸附膜专一吸附吸附DNA；而在低盐、高低盐、高pH值值条件下，洗脱洗脱DNA。从凝胶中回收DNA片段适用范围从几十适用范围从几十bp到几十到几十Kb。回。回收效率不等。收效率不等。吸附吸附DNA洗脱洗脱DNA洗脱洗脱DNA吸附吸附DNA融胶融胶去除杂质去除杂质去除残去除残存酒精存酒精纯化DNA样品【实验材料】【实验材料】n目的片段目的片段:pBluesrcipt上含插入 片段(分子量约1.0 kb)n 载体载体质粒:pBluesrcipt(分子量约2.9 kb);用EcoRI/BamHI双酶切载体载体目的目的片段片段【实验材料】【实验材料】n 载体载体质粒:pBluesrcipt(分子量约2.9 kb)载体上，经EcoRI/BamHI双酶切，电泳后胶回收纯化2.9kb 载体载体片段片段；n目的片段目的片段质粒:pBluesrcipt(分子量约2.9 kb)载体上含插入 片段(分子量约1.0 kb)，经EcoRI/BamHI双酶切，电泳后胶回收纯化1.0 kb目的片段目的片段。n从凝胶中切出两端均含有EcoRI/BamHI酶切粘性末端的2.9kb 载体片段与1.0 kb目的片段连接起来质粒DNA双酶切产物 载体片段目的片段【实验分组】【实验分组】1.质粒质粒DNA酶切酶切：每人设置1个酶切反应，用EcoRI/BamHI双酶切2.5-3g质粒DNA（将获得载体DNA和目的DNA片段）最好酶切用试剂盒提取的质粒DNA。2.DNA电泳电泳：每人1个DNA酶切样品，4人一组上样，需配制9-10块浓度为0.8%的琼脂糖凝胶（可将两个样品孔用胶带黏贴在一起，形成一个大上样孔，上样量增至60-70l。选择长胶板，如每块胶有8个样品孔,可以上4个酶切样品）。助教(或由有经验的同学)指导配胶。(每个电泳槽跑两块胶。)3.DNA片段从凝胶中切出片段从凝胶中切出：每人各自操作（可两人合作：一人拿紫外灯照胶，另一人切胶）。【实验时间安排】【实验时间安排】1.每人设置1个酶切反应（分别获得载体和目的片段）（20分钟）；2.37酶切1-1.5小时；3.酶切等待时配制浓度为0.8%的琼脂糖凝胶；4.上样后跑电泳期间吃午饭（45-50分钟）；5.用观胶仪快速拍照（分组依次进行，约需10-20分钟）；6.切取含DNA片段的胶条置于标记好的（班级、姓名、质粒DNA、酶切所用酶、时间）离心管中（每两人5-8分钟，分组依次进行，约需30-35分钟）。7.称量胶条重量，加入溶胶液（5分钟）。质粒质粒DNA 2.5-3 g X l(根据电泳估测浓度来加)10Tango buffer 10 l ddH2O Y l EcoR I 酶(Thermo Scientific)2 l(20U)BamHI 酶(Thermo Scientific)3 l(30U)总体积 50 l n用移液枪头混匀各溶液，台式离心机上离心10秒。37酶切1-1.5小时。n反应结束后，加入10l 6上样缓冲液，上样到0.8%琼脂糖凝胶上，电泳(100V,45-50分钟)分离酶切产物。建议酶切反应体系【实验步骤】【实验步骤】n在标记好的离心管中依次加入以下各试剂:无菌水、10酶切buffer、质粒DNA、限制性内切酶(注意内切酶最后加，且在冰上操作)n质粒质粒DNA双双酶切酶切n将将DNA片段从琼脂糖凝胶中切出片段从琼脂糖凝胶中切出n切切胶胶用观胶仪快速拍照（避免凝胶长时间暴露在紫外光下导致DNA断裂）；从凝胶中切出所需DNA片段:先在可见光下把含DNA片段的凝胶纵向分割开，再在紫外灯下切取所需DNA片段，尽量去除DNA片段旁边多余的凝胶(每管凝胶不要超过400mg,否则溶胶不完全)；n称重称重用干净的镊子将凝胶条置于标记好(班级、姓名、质粒DNA、酶切所用酶、时间)的离心管中；称量盛有胶条的离心管重量(减去空离心管重量，即为胶条重量)，保存于-20冰箱，以备下星期做胶回收用。n 更多注意事项，详见“生工质粒DNA提取试剂盒使用说明”pdf【结果与分析】【结果与分析】1.记录紫外观胶仪上观察到质粒DNA片段(载体DNA及插入片段)经EcoR I/BamHI 双酶切后的结果。2.分析实验结果的成因。1.酶切反应过程中应注意哪些问题？2.从琼脂糖凝胶中切取所需DNA片段时应注意些什么？【问题与讨论】【问题与讨论】1.内切酶失活2.DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子3.条件不适（试剂、温度）4.DNA酶切位点上的碱基被甲基化5.DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）6.DNA位点上存在其它修饰7.DNA不存在该酶识别顺序1.用标准底物检测酶活性2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3.检查反应系统是否最佳4.换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5.换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增6.将DNA底物与DAN混匀进行切割验证7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析n问题一：DNA完全没有被内切酶切割 原因原因对对策策1.内切酶活性下降2.内切酶稀释不正确3.DNA不纯，反应条件不佳4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰5.部分DNA溶液粘在管壁上6.内切酶溶液粘度大，取样不准7.酶切后DNA粘末端退火8.由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性9.过度稀释使酶活性降低10.反应条件不适11.识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序1.用5-10倍量过量消化2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.同上4.同上5.反应前离心数秒6.将内切酶稀释，增大取样体积7.电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8.使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10.使用最佳反应体系11.加大酶量5-10倍n问题二：DNA切割不完全限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析 原因原因对对策策1.内切酶星状活性2.其它内切酶污染3.底物中含其它DNA杂质1.检查反应条件：甘油浓度大于10%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量2.用DNA作底物检查酶切结果3.电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段n问题三：DNA片段数目多于理论值限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析 原因原因对对策策1.DNA定量错误（如RNA含量较高）2.在酶切反应液中形成非特异的沉淀1.用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样品，酚氯仿抽提后沉淀溶解，定量2.在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次n问题四：酶切后没有观察到DNA片段的存在限制性内切酶酶切常见问题分析限制性内切酶酶切常见问题分析 原因原因对对策策1.DNA降解2.电泳缓冲液陈旧3.所用电泳条件不合适4.DNA上样量过多5.DNA样含盐过高6.有蛋白污染7.DNA变性1.避免核酸酶污染2.电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液3.电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4.减少凝胶中DNA上样量5.电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6.电泳前酚抽提去除蛋白7.电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析n问题一：DNA条带模糊 原因原因对对策策1.电泳条件不合适2.DNA变性1.电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液2.以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热n问题二：不规则DNA条带迁移DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 原因原因对对策策1.DNA的上样量不够2.DNA降解3.DNA走出凝胶4.所用光源不合适EB或其它染料染色的DNA1.增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低2.避免DNA的核酸酶污染3.缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4.应用短波长（254nm）的紫外光源n问题三：DNA条带弱或无条带DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 原因原因对对策策1.小DNA带走出凝胶2.分子大小相近的DNA带不易分辨3.DNA 变性4.DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适1.缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2.增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3.电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA4.在脉冲凝胶电泳上分析n问题四：缺失DNA条带DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 原因原因对对策策
