遗传与分子生物学实验 (18).pdf

酶切注意事项及问题酶切注意事项及问题一一内切酶内切酶的选用的选用1.根据模板 DNA 序列选用合适的内切酶来酶切，优先选择酶切后能形成粘性末端的内切酶。如果采用双酶切，先要注意两个酶切位点之间有足够的间隔序列，以确保两个酶都有足够的作用空间，还需注意两种酶有共同适宜的酶切反应缓冲液。2.内切酶的用量用量：根据内切酶单位和 DNA 用量而定，通常 1U（unit,单位）指在适当条件下，1 小时内完全酶解g 特定 DNA 底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以gDNA 用 2-3U 酶短时间酶切为宜。3.内切酶体积体积不能超过反应体系 10，因内切酶中含 50甘油，体系中甘油超过 5会抑制内切酶活力，可能产生星号活性。4.正确使用和保存内切酶。1酶需要保存在-20 度的低温环境中，只有在需要用酶在需要用酶时时才从冰箱中取出来才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶置于冰上，手拿酶管时不要接触酶管下部含酶的部分。2吸取酶时尽可能用长移液枪头,防止操作中引入其它内切酶或外切酶的污染。3由于酶液含有 50%甘油，比较粘稠，应采用反向移液方法移液（吸液时移液器按钮按到第二档吸液，释放按钮；放液时，按到第一档打出液体，将液体排出）可减少喷溅、泡沫和气泡形成。并注意慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度，因为吸液速度过快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。4用完后需要及时送回冰箱存放原处。注意：酶要最后加。二二模板模板 DNADNA 的纯度的纯度DNA 应具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、高盐浓度等，它们均不同程度影响限制性内切酶的活力。可通过以下方法来克服：增加酶作用单位数（1015U/g DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂、或延长反应时间。三酶切三酶切反应反应条件条件1.反应缓冲液主要由 TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中 Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl 维持反应体系 pH 值在 7.2-7.6 之间；NaCl 浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)、中盐（50mM NaCl）、高盐（100mM NaCl）。不同的内切酶有特定的最适反应缓冲液。如果采用双酶切，需注意采用两种酶共同适宜的反应缓冲液。2.酶切反应体积需要根据实验目的来定，注意 DNA 模板用量、酶用量和反应体积的关系。3.酶切反应温度一般选择 37 度，但少数酶，如 Sma I 的最适合作用温度是 25 度，37 度时酶仍表现出活性，但是效率下降 50%。4.酶切反应时间的选择。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理。在使用高酶量的时候需要注意，内切酶的总体积不应超过酶切总反应体积的 10%（酶保存在 50%的甘油中，当反应中甘油的终浓度超过 5%时会引起酶的星号反应）。如采用 60l的反应体系，酶的总用量不能超过 6l。5.酶切反应的各个组分加完后，需要用移液枪头小心混匀几次，快速离心一下就可以保温了，一般不能使用振荡器混匀。