水稻组织培养.ppt
水稻组织培养实验原理植物组织培养主要利用了植物细胞的全能性，细胞全能性(toti potency)就是指每个生活的细胞中都包含有产生一个完整机体的全套基因，在适宜的条件下，细胞具有形成一个新的个体的潜在能力。材料选取水稻种子(干种子或是湿种子均可)作为植物组织培养的外植体仪器电子天平、酸度计、微量移液器、电炉、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻璃棒、试剂瓶、超净工作台、剪刀、镊子、照度计、摇床、灭菌锅培养基母液配置大量元素母液配制:母液 A1(浓缩10倍):称取KNO3 19g、NH4NO3 16.5g、MgSO47H2O 3.7g、KH2PO4 1.7g，分别溶解后混合并定容至 1000ml，4保存备用;母液A2（浓缩10倍）：称取CaCl22H2O 4.4g 定容至1000ml，4保存备用。微量元素母液配制(母液 B，浓缩 100 倍)称取 MnSO44H2O 2.23g、ZnSO47H2O 860mg、H3BO3 620mg、KI 83mg、NaMO42H2O 25mg、CuSO45H2O 2.5mg、CoCl6H2O 2.5mg，分别溶解并混合后定容至1000ml，4保存备用。铁盐母液配制(母液C 浓缩 100 倍):称取Na2-EDTA 3.77g、FeSO47H2O 2.78g、分别溶解并混合后定容至 1000ml，4保存备用。有机物质母液配制(母液 D，浓缩50倍):称取甘氨酸 100mg、盐酸硫胺素20mg、盐酸吡哆素25mg、烟酸E25mg、肌醇 5000mg，分别溶解后混合并定容至 500ml，4保存备用。生长调节物质母液配制:为了操作方便，生长调节剂也可先配制成母液(药品在配制时若不溶于水，可用少量溶剂先溶解，如萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3），2,4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量 95 酒精溶解，然后加水，若溶解不完全再加热;激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量 1mol/L 的 HCL 中，叶酸需用少量稀氨水溶解称取 50mg 生长调节物质，溶解后，蒸馏水定容至 100ml，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，4保存备用。MS固体培养基的配制及灭菌取 1000ml烧杯一只，加 500ml 水，然后加琼脂 10g，放至电炉子上(铺有石棉网)加热，边加热边搅拌至琼脂完全溶解(然后加蔗糖或白糖)30g 搅拌至其溶解;分别称取母液 A1 100ml、母液 A2 100ml、母液 B 10ml、母液C 10ml、母液D 10ml，到此烧杯中，搅拌均匀后用 0.5mol/L HCL 或 0.5mol/L 的 NaOH将培养基 PH 调至 5-8左右。不同培养阶段所需要的生长调节物质有很大的不同，因此不同阶段的培养基中要加入的生长调节物质是不一样的，如愈伤组织诱导培养基（MS+2,4-D2.0mg/L）中2,4-D为每升2.0mg，而2,4-D母液的浓度为0.5mg/ml，则配制时要从其母液中吸取4mL。培养基配制好后，将其分装至150mL三角瓶中，每瓶40mL左右。用两层牛皮纸或硫酸纸将装好培养基的瓶口包裹住，用3个乳胶圈将瓶口封紧即可灭菌。培养基的灭菌条件为121，25min左右，灭菌时要将无菌操作的所需的备品灭全，包括剪刀、镊子、刀片、无菌水、报纸或滤纸等。外植体的表面消毒及接种选取饱满成熟的水稻种子，手工剥去颖壳，选取干净完整的颖果(在超净工作台内，先用 75酒精处理 30s，再用 0.1升汞处理 10min 或 2次氯酸钠溶液 15min，然后用无菌水冲洗 56次(用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干，然后用镊子夹取水稻种子轻轻放到愈伤组织诱导的培养基表面，每瓶 5 粒左右(每接 5 瓶左右，用75 酒精擦拭手和台面，进行消毒。不同培养阶段的培养基配方及培养条件：愈伤组织诱导和继代培养基为MS+2,4一D 2.0mg/L，培养条件为黑暗培养，温度控制在26(1);愈伤组织分化芽培养基为MS+6一BA 2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L，光照强度为3000lux左右，光照时间为14h,温度控制在26(1);生根培养基为1/2MS+NAA 1.0 mg/L，光照强度为4000lux左右，光照时间为14h,温度控制在26(1)。实验结果根据上述培养基配方所建立起来的水稻植株再生体系，愈伤组织诱导率)芽分化率及生根率均较高。水稻种子在诱导培养中培养10天左右，从水稻芽的基部长出淡黄色)呈细小颗粒状的愈伤组织(图 A)（水稻种子在诱导培养中所得到的愈伤组织）将愈伤组织转入分化芽的培养基后约7天，开始出现绿点并逐渐增多(图 B）（愈伤组织在分化芽的培养基中出现绿点）约5天后，原来出现绿点的愈伤组织整体颜色加深，并有部分芽已向小苗过渡(图 C)（由绿点所长成的丛生芽）约10天后，有丛生芽长成的幼苗逐渐增多，已有部分幼苗叶片展开(图 D)（由丛生芽长成的绿色幼苗）将幼苗的植株移至生根培养基中。3天左右即可生出根，然后逐渐增多，此时可以明显看见在培养基中的生出的根(图 E)（绿色幼苗在分化根的培养基中生出的根)当水稻组培苗长高至 35cm时，即可进行炼苗，将三角瓶口打开放置室温下，一定避免强光直射，炼苗3天左右即可进行移栽(图 F)(炼苗及移栽成活的水稻再生植株)水稻炼苗方法有组培苗的培养瓶开口，培养基上覆水，约1 cm，置于温室3天左右，然后移栽到土中先将组培苗水培半个月，水稻营养液要求pH 5，待苗壮实后，移栽到土中。水稻种子做组织培养的优点操作简单，节省时间水稻外植体小，进行表面消毒后不易染菌，愈伤组织诱导率较高水稻种子保存容易且存活时间更长，可以随时取材实验参考文献1盛玉婷.2008.植物组织培养技术及应用进展(安徽农学通报，14(9):45472张志良，翟伟菁.2003.植物生理学实验指导(北京:高等教育出版社，3263273倪晋山，1985.植物生理学实验手册（薛应龙主编），上海科学技术出版社，63-64
