第六章-酶工程制药ppt课件.ppt

病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程复习复习1 1、简述多抗、单抗制备的主要程序、简述多抗、单抗制备的主要程序？2 2、简答鼠源抗体在免疫导向中存在的缺陷？、简答鼠源抗体在免疫导向中存在的缺陷？3 3、基因工程抗体、抗体组合文库的概念、基因工程抗体、抗体组合文库的概念?作业：作业：1、酶和细胞的固定化？、酶和细胞的固定化？2、酶在医药领域的应用？、酶在医药领域的应用？病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第六章第六章 酶工程制药酶工程制药l教学重点：教学重点：掌握固定化技术、酶的修饰、酶工程在制药工业掌握固定化技术、酶的修饰、酶工程在制药工业的应用；了解酶特点及分离纯化。的应用；了解酶特点及分离纯化。l教学难点：教学难点：酶反应器酶反应器 l课时：课时：6 6学时学时病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程主要内容主要内容l第一节第一节 概述概述l第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化l第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化l第四节第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器l第五章第五章 固定化酶产品介绍固定化酶产品介绍（自学）（自学）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程概述概述一、一、酶工程简介酶工程简介二、二、酶的基础知识酶的基础知识三、三、现代酶工程的主要内容现代酶工程的主要内容四、四、酶的来源和生产酶的来源和生产五、五、酶在医药领域的应用酶在医药领域的应用病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第一节第一节 概述概述一、一、酶工程酶工程简介简介 酶工程是酶工程是酶学酶学和和工程学工程学相互渗透结合、发展而相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。化将相应原料转化成有用物质的技术。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程酶工程的名称出现在酶工程的名称出现在2020世纪世纪2020年代，主要指自然年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。酶制剂在工业上的规模应用。19531953年，德国人提出了年，德国人提出了酶固定化技术酶固定化技术 。19691969年，日本人用固定化技术拆分了年，日本人用固定化技术拆分了DL-DL-氨基酸。氨基酸。19711971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二二 、酶的基础知识、酶的基础知识（一）酶是生物催化剂（一）酶是生物催化剂酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。剂。催化高效性催化高效性专一性：专一性：结构专一性；结构专一性；立体异构专一性立体异构专一性酶具有不稳定性酶具有不稳定性病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程8（二）酶的化学本质（二）酶的化学本质蛋白质蛋白质酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）（全酶）=酶蛋白酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶与酶蛋白结合得牢固的小分子有机物。与酶蛋白结合得牢固的小分子有机物。辅基辅基与酶蛋白结合得松散的小分子有机物。与酶蛋白结合得松散的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂金属离子作为辅助因子。金属离子作为辅助因子。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程9必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。酶的活性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。催化作用直接有关的部位。必需基团必需基团活性部位活性部位维持酶的空间结构维持酶的空间结构结合基团结合基团催化基团催化基团专一性专一性催化性质催化性质病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、现代酶工程的主要内容：三、现代酶工程的主要内容：1.1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；用开发；2.2.酶和细胞的酶和细胞的固定化固定化及及酶反应器酶反应器的研究，包括的研究，包括酶传感器、反应检测；酶传感器、反应检测；3.3.酶生产中酶生产中基因工程技术基因工程技术的应用及的应用及遗传修饰酶遗传修饰酶的研究；的研究；4.4.酶的分子酶的分子改造改造和化学和化学修饰修饰，结构与功能的研，结构与功能的研究；究；病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程5.5.有机相中酶反应有机相中酶反应的研究；的研究；6.6.酶的酶的抑制剂、激活剂抑制剂、激活剂的开发与应用研究；的开发与应用研究；7.7.抗体酶抗体酶、核酸酶核酸酶的研究；的研究；8.8.模拟酶、合成酶模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研及酶分子的人工设计、合成研究。究。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程12四、酶的来源和生产四、酶的来源和生产（一）酶的来源（一）酶的来源 酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成，基因工程。的是合成，基因工程。早期酶的生产：以动植物为主要原料，如早期酶的生产：以动植物为主要原料，如激肽释放酶激肽释放酶（胰脏）（胰脏）、菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶。近近1010年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。工业生产一般都以微生物为主要来源。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程13微生物生产酶的特点微生物生产酶的特点1.1.微生物微生物种类繁多种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生物中得到；从微生物中得到；2.2.微生物微生物繁殖快繁殖快、生、生产周期短产周期短、培养简便培养简便，并可通过控制，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；培养条件来提高酶的产量；3.3.微生物具有微生物具有较强的适应性较强的适应性，通过各种，通过各种遗传变异遗传变异的手段，的手段，能培育出新的高产菌株。能培育出新的高产菌株。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程14（二）酶的生产菌（二）酶的生产菌1 1、对菌种的要求：、对菌种的要求：（1 1）产酶量高、酶的性质符合要求、最好是胞外酶；）产酶量高、酶的性质符合要求、最好是胞外酶；（2 2）不是致病菌；）不是致病菌；（3 3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；（4 4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程152 2、生产菌的来源：、生产菌的来源：1 1）菌种保藏机构和有关研究部门，但大量的工作）菌种保藏机构和有关研究部门，但大量的工作应是从自然界中分离筛选应是从自然界中分离筛选菌样采集、菌种菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。2 2）改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。）改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程163 3、目前常用的产酶微生物、目前常用的产酶微生物E.coliE.coli：是应用最广泛的产酶菌。是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、霉素酰化酶、-半乳糖苷酶半乳糖苷酶枯草杆菌：枯草杆菌：主要用于生产主要用于生产-淀粉酶、淀粉酶、-葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。酶、碱性磷酸脂酶。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程17啤酒酵母：啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等；用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等；曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。酶。其他产酶菌：其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程五、酶在医药领域的应用五、酶在医药领域的应用1.1.在疾病诊断方面的应用在疾病诊断方面的应用由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简和等催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。酶学诊断方法：酶学诊断方法：1 1）是根据体内）是根据体内原有酶活力的变化原有酶活力的变化来诊断某些疾来诊断某些疾病，病，2 2）利用酶来测定体内某些物质的含量利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊，从而诊断某些疾病。断某些疾病。18病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程根据体内酶活力的变化诊断疾病根据体内酶活力的变化诊断疾病:一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。诊断出某些疾病。胰腺癌：胰蛋白酶、胰型同胰腺癌：胰蛋白酶、胰型同工酶等升高工酶等升高肝炎：转氨酶升高肝炎：转氨酶升高 19病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程用酶测定用酶测定体液中体液中某些物质的变化诊断疾病：某些物质的变化诊断疾病：人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某些疾病。某些疾病。20病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程2.2.在疾病治疗方面的应用在疾病治疗方面的应用-酶类制剂酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为的酶称为药用酶药用酶。药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛。病的治疗方面的应用越来越广泛。溶菌酶：抗菌消炎和镇溶菌酶：抗菌消炎和镇痛痛21病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1 1）消化类：）消化类：研究最早，是品种最多的一类酶研究最早，是品种最多的一类酶.在这一类酶中主要有胃蛋白酶、在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等等。健美生消化酶健美生消化酶帮助肠胃蠕动帮助肠胃蠕动22病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程2 2）抗炎净创类）抗炎净创类：目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，-淀粉酶、淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等胰脱氧核糖核酸酶等。23病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程3 3）血凝和解凝类：）血凝和解凝类：都是从血液中提取出来的。都是从血液中提取出来的。凝血酶的作用凝血酶的作用：促使血中纤维蛋白原变成不溶性纤促使血中纤维蛋白原变成不溶性纤维蛋白维蛋白,从而促使血液凝固，防止微血管出血。例从而促使血液凝固，防止微血管出血。例如：蛇毒抗凝酶、促凝血酶原激酶。如：蛇毒抗凝酶、促凝血酶原激酶。纤维蛋白溶解酶的作用：纤维蛋白溶解酶的作用：是溶解血块，为目前临床是溶解血块，为目前临床上最新的一种酶制品上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。例如栓塞等。例如:东菱克栓酶东菱克栓酶抑肽酶作为肽酶抑制剂：抑肽酶作为肽酶抑制剂：广泛应用于体外循环手术，广泛应用于体外循环手术，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血，消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡。24病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程4 4）解毒类：）解毒类：主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。种有害物质。主要品种有主要品种有青霉素酶青霉素酶、过氧化氢酶过氧化氢酶和和组织胺酶组织胺酶等。等。青霉素酶能够分解青霉素分子（青霉噻唑）中的青霉素酶能够分解青霉素分子（青霉噻唑）中的一内酰胺环，使变成青霉素铜酸，消除因注射一内酰胺环，使变成青霉素铜酸，消除因注射青霉素引起的过敏反应青霉素引起的过敏反应。25病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程265 5）抗肿瘤的药用酶：）抗肿瘤的药用酶：L-L-天冬氨酸酶是第一种用于治疗白血病的酶；天冬氨酸酶是第一种用于治疗白血病的酶；癌细胞缺乏天冬氨酸合成酶，自身生长时不能合癌细胞缺乏天冬氨酸合成酶，自身生长时不能合成天冬氨酸，成天冬氨酸，L-L-天冬氨酸酶可以切断外来的天天冬氨酸酶可以切断外来的天冬氨酸供给。冬氨酸供给。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程3.3.在药物生产方面的应用在药物生产方面的应用利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的的。4.4.在分析检测方面的应用在分析检测方面的应用酶法检测或酶法分析酶法检测或酶法分析如：如：ELISA,ELISA,免疫组织化学，免疫组织化学，Western blotWestern blot中的中的HRPHRP27病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1 1、细胞破碎、细胞破碎2 2、酶的提取、酶的提取3 3、酶的分离方法、酶的分离方法4 4、酶的组合分离纯化策略、酶的组合分离纯化策略5 5、酶的浓缩、干燥与结晶、酶的浓缩、干燥与结晶第二节第二节 酶的分离纯化酶的分离纯化28病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、酶的分离纯化技术路线一、酶的分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二、酶的提取二、酶的提取（一）（一）细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1 1）机械破碎）机械破碎2 2）物理破碎）物理破碎3 3）化学破碎）化学破碎4 4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机细胞胞破破碎碎珠珠高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机30病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1.1.采用缓冲体系：防采用缓冲体系：防PHPH大幅度变化而失活大幅度变化而失活2.2.添加保护剂：防活性基团活性中心受影响添加保护剂：防活性基团活性中心受影响3.3.抑制水解酶的作用：加酶抑制剂抑制水解酶的作用：加酶抑制剂4.4.其他保护措施：温度，其他保护措施：温度，PHPH，搅拌，光照，氧化等，搅拌，光照，氧化等影响影响为了保护目的酶的生物活性，常采取下列保护为了保护目的酶的生物活性，常采取下列保护措施：措施：31病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（二）酶的（二）酶的抽提抽提提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提盐溶液提取取0.020.020.5M0.5M的盐溶的盐溶液液用于提取在低浓度盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶中溶解度较大的酶酸溶液提酸溶液提取取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的解度大，且稳定性较好的酶酶碱溶液提碱溶液提取取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂有机溶剂提取提取可与水混溶的有机可与水混溶的有机溶剂溶剂用于提取那些与脂质结合用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基牢固或含有较多非极性基团的酶团的酶将酶从生物组织或细胞破碎液以溶将酶从生物组织或细胞破碎液以溶解状态最大限度释放出来的过程。解状态最大限度释放出来的过程。32病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程(三）沉淀分离三）沉淀分离沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同，在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀从溶液中析出沉淀等电点沉淀法等电点沉淀法两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两性电解质有不同的等电点，通过调节溶液的性电解质有不同的等电点，通过调节溶液的pHpH值，使酶或杂质沉淀析出值，使酶或杂质沉淀析出有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀法法酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，添酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出出复合沉淀法复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来而沉淀下来选择性变性选择性变性沉淀法沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶沉淀，而不影响所需的酶粗提物：经细胞破碎和抽提后，得粗提物：经细胞破碎和抽提后，得到的含目的酶的无细胞抽提物。到的含目的酶的无细胞抽提物。33病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（四）、酶的纯化（四）、酶的纯化过滤与膜分离过滤与膜分离电泳电泳离子交换层析离子交换层析34病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备1 1、固定化酶的定义、固定化酶的定义:指限制或固定于特定空间位指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。35病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 2、固定化酶的特点、固定化酶的特点（1 1）可以多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。无残留酶，易于纯化。（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；化和自动控制；（4 4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；用酶量少；（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。36病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法热处理热处理（细胞）（细胞）物理吸物理吸附法附法共价结共价结合法合法离子结离子结合法合法载体结载体结合法合法交联交联法法包埋包埋法法网格型网格型微囊型微囊型3.酶的固定化方法与技术酶的固定化方法与技术病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程38病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（1 1）载体结合法）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。化方法。A.A.物理吸附法：物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃多孔玻璃,树脂等树脂等优点优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再用。后载体仍可再用。缺点：缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。于脱落，导致酶活下降并污染产物。39病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 B B、离子结合法：、离子结合法：酶通过离子键结酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性合于具有离子交换基的水不溶性载体上。载体上。DEAE-纤维素等纤维素等优点：优点：操作简单，处理条件温和，操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。酸残基不易被破坏。缺点：缺点：载体和酶的结合力弱，易受载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或缓冲液种类或pH的影响，离子的影响，离子强度高时，酶易脱落。强度高时，酶易脱落。40病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程C、共价结合法：、共价结合法：酶以共酶以共价键结合于载体上。即将价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。行共价结合的方法。优点：优点：酶与载体结合牢固，酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落稳定性好，不易脱落。缺点：缺点：反应条件苛刻，操反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻酶易失活和产生空间位阻效应。效应。41病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（2）交联法）交联法：用双功能或多用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。细胞之间交联的方法。交联法交联法交联酶法交联酶法酶与辅助蛋白交联法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法吸附交联法载体交联法载体交联法常用的交联剂：戊二醛、双常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺重氮联苯胺-2-2、2-2-二磺酸、二磺酸、1,5-1,5-二氟二氟-2,4-2,4-二硝基苯。二硝基苯。42病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；酶分子；（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；溶性的固定化酶；（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶43病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（3）包埋法：）包埋法：A、网格型：、网格型：将酶或细胞包埋在将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶，胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶，多用于固定化细胞。多用于固定化细胞。44病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程B、微囊型、微囊型：将酶或细胞包将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微通常为直径几微米到几百微米的球状体。米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成但反应条件要求高，制备成本也高。本也高。45病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程46病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程新型的酶固定化方法新型的酶固定化方法温和的条件温和的条件下进行，减少酶活力损失，提下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率高固定化效率光偶联法：光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定化光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶无载体固定化酶：无载