第03章 蛋白质的通性、纯化与表征.ppt

第第03章章 蛋白质的性质和分离纯化蛋白质的性质和分离纯化Properties and Purification of Protein生生 物物 化化 学学Biochemistry生命科学与技术学院生命科学与技术学院 陈吉宝陈吉宝 u蛋白质是一种两性电解质蛋白质是一种两性电解质1、蛋白质的酸碱性质、蛋白质的酸碱性质pH=6u蛋白质份子表面分布着不同的电荷。蛋白质份子表面分布着不同的电荷。u蛋白质等电点：使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等时溶液的pH值为蛋白质的等电点（pI）。u蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。蛋白质溶液处于等电蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小。点时，溶解度最小。u由由于于蛋蛋白白质质表表面面极极性性基基团团形形成成的的水水化化膜膜，非非等等电电状状态态时时，同同种种电电荷荷的的互互相相排排斥斥，质质点点大大小小在在1-100nm，故故蛋蛋白白质质水水溶溶液是胶体溶液液是胶体溶液。u稳定蛋白质胶体溶液的主要因素稳定蛋白质胶体溶液的主要因素水化层水化层(hydration shell);静电排静电排斥斥：2、蛋白质的胶体性质与沉淀、蛋白质的胶体性质与沉淀一旦电荷被中和或水化膜被破坏，一旦电荷被中和或水化膜被破坏，在蛋白质的疏水作用下，蛋白质颗在蛋白质的疏水作用下，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。粒聚集，便从溶液中析出沉淀。u蛋白质沉淀蛋白质沉淀(precipitation)(precipitation)的方法的方法重重金金属属盐盐沉沉淀淀法法：pH大大于于等等电电点点时时，蛋蛋白白质质带带负负电电荷荷，可可与与重重金金属属离离子子结结成成不不溶溶性性沉沉淀淀（Ca 2+、Mg 2、Ba 2+、Pb 2+与与羧羧基基结结合合；Mn 2、Zn 2、Fe 2+、Cu 2+、Co 2+、Ni 2+与与羧羧基基、含含氮氮化化合合物物及及杂杂环环化化合合物物结结合合；Ag+、Hg 2+、Pb 2+能能与与巯巯基基结结合合）。重金属沉淀的蛋白质常是变性的重金属沉淀的蛋白质常是变性的。有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀法法：与与蛋蛋白白质质份份子子争争夺夺水水分分子子，破破坏坏蛋蛋白白质质表表面面的的水水化化膜膜，降降低低介介电电常常数数。使使用用较较多多的的有有机机溶溶剂剂是是乙乙醇醇、甲甲醇醇等等。在在常常温温下下，有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀蛋蛋白白质质往往往往引引起起变变性性。例例如如酒酒精精消消毒毒灭灭菌就是如此。菌就是如此。盐盐析析法法：向向蛋蛋白白质质溶溶液液中中加加入入大大量量的的中中性性盐盐(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl，使使蛋蛋白白质质脱脱去去水水化化层层而而聚聚集集沉沉淀淀。蛋蛋白白质质不不变变性。性。生生物物碱碱试试剂剂和和某某些些酸酸类类沉沉淀淀法法：pHpH小小于于等等电电点点时时，蛋蛋白白质质带带正正电电荷荷，易易与与生生物物碱碱试试剂剂和和酸酸类类的的负负离离子子生生成成不不溶溶性性沉沉淀淀。生生物物碱碱试试剂剂：是是指指能能引引起起生生物物碱碱沉沉淀淀的的一一类类试试剂剂，单单宁宁酸酸、苦苦味味酸酸、钨酸。酸钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。类：三氯乙酸、磺基水杨酸。加加热热变变性性沉沉淀淀：将将接接近近于于等等电电点点附附近近的的蛋蛋白白质质溶溶液液加加热热，热稳定性差的蛋白质将发生变性热稳定性差的蛋白质将发生变性而凝固而凝固沉淀。沉淀。3、蛋白质的分离纯化、蛋白质的分离纯化 蛋白质分离纯化的总目标蛋白质分离纯化的总目标：增加制品的纯度或比活性（单位：增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性）。蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性）。3.1.1 前处理(pretreatment)释放蛋白质释放蛋白质将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理 植物组织和细胞：石英砂+提取液、研磨、纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理收集细胞的某一组分：差速离心法如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。3.1 一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存3.1.2 粗分级粗分级(rough fractionation)去杂质蛋白质去杂质蛋白质和其它大分子和其它大分子 一般用选择性沉淀法：一般用选择性沉淀法：盐析（例如用盐析（例如用(NH4)2SO4分级沉淀）分级沉淀）；等电点选择性沉淀法；等电点选择性沉淀法；有机溶剂分级沉淀法；有机溶剂分级沉淀法；热处理热处理选择性沉淀法；选择性沉淀法；生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法3.1.3 细分级细分级（fine fractionation)纯化纯化 透析除盐；透析除盐；凝胶过滤除盐；凝胶过滤除盐；层析法：凝胶过滤层析、层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）；）；电泳法；电泳法；密度梯度离心。密度梯度离心。3.1.4 浓缩与保存浓缩与保存 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节加有机溶剂、调节pH等。等。冻干粉保存：在冷冻状态下让样品中的液体升华。冻干粉保存：在冷冻状态下让样品中的液体升华。溶液保存：加入抗冻剂（溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后甘油）后-20-70保存。保存。u蛋白质分子的大小：蛋白质分子的大小：透析透析、超滤、密度梯度离心、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤凝胶过滤u蛋白质溶解度：蛋白质溶解度：盐析盐析、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀等电点沉淀u蛋白质电荷状况：蛋白质电荷状况：凝胶电泳凝胶电泳、等电聚焦、等电聚焦、离子交换层析离子交换层析u蛋白质吸附性质：蛋白质吸附性质：羟基磷灰石吸附层析、疏水作用层析羟基磷灰石吸附层析、疏水作用层析u蛋白质生物学亲和性：蛋白质生物学亲和性：亲和层析亲和层析3.2 常见蛋白质分离纯化的方法与原理常见蛋白质分离纯化的方法与原理 透析：半透膜阻留pro分子，而让小的溶质分子（无机盐）和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸，单糖等）。超滤：施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。1）透析和超滤）透析和超滤2）凝胶过滤层析）凝胶过滤层析（GFC）V Vt t-V-Vo o 或或V Vi i+V+Vm mV Vt tV Vo ou分离介质分离介质:凝胶颗粒（交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖等），凝胶颗粒（交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖等），具有不均匀的网状结构具有不均匀的网状结构u分离机制：分离机制：分子筛效应，即分子筛效应，即根据蛋白质分子大小不同来分离蛋根据蛋白质分子大小不同来分离蛋白质，白质，大分子大分子物质物质最先流出柱外，最先流出柱外，小分子物质小分子物质最后流出柱外最后流出柱外。分配系数Kd 可以把凝胶层析看成是可以把凝胶层析看成是液液-液分配层析液分配层析。固定相是凝胶珠。固定相是凝胶珠内部水相（内部水相（Vi），流动相是凝胶外部水相（），流动相是凝胶外部水相（Vo）。）。Kd为样品为样品在两相间的分配系数，也可以说在两相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝是分子量不同的溶质在凝胶内部胶内部水水和外部和外部水中水中的分配系数，的分配系数，它它只与被分离物分子的大只与被分离物分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的粗细长短无关，小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的粗细长短无关，也就是说它对特定物质为常数，与柱的物理条件无关。也就是说它对特定物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd=(Ve-Vo)/Vi 在限定的层析条件下，在限定的层析条件下，VtVt和和VoVo都为恒定值，都为恒定值，VeVe值是随着值是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质量大，分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质量大，K Kd d值值小；反之，小；反之，K Kd d值增大。值增大。(3)当当0Kd1，表示凝胶对分子有吸附作用，此时，表示凝胶对分子有吸附作用，此时VeVo+Vi，例如一，例如一些芳香族化合物苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在些芳香族化合物苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在Sephadex G-25中中的的Kd值分别为值分别为1.2，1.4和和2.2。(1)当当Kd=0时时，分子根本，分子根本不能进入凝胶内部不能进入凝胶内部(全排全排阻阻)，洗脱体积等于空隙，洗脱体积等于空隙容积，即容积，即Ve=Vo(I)。(2)当当Kd=1时，分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为外水时，分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为外水体积与内水体积之和，即体积与内水体积之和，即Ve=Vo+Vi()。Kd可以有下列几种情况可以有下列几种情况分子量大洗脱体积小，分子量小洗脱体积大分子量大洗脱体积小，分子量小洗脱体积大uu常用于：常用于：常用于：常用于：分分分分离离离离纯纯纯纯化化化化蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质(包包包包括括括括酶酶酶酶类类类类)、核核核核酸酸酸酸、多多多多糖糖糖糖、激激激激素素素素、氨氨氨氨基酸和抗生素等物；基酸和抗生素等物；基酸和抗生素等物；基酸和抗生素等物；uu还可用于还可用于还可用于还可用于:测定测定测定测定蛋白质的蛋白质的蛋白质的蛋白质的分子质量分子质量分子质量分子质量，样品的，样品的，样品的，样品的浓缩浓缩浓缩浓缩和和和和脱盐脱盐脱盐脱盐等方面。等方面。等方面。等方面。3）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法定义定义 向向水水溶溶液液中中加加入入一一定定量量亲亲水水性性的的有有机机溶溶剂剂(如如甲甲醇醇、乙乙醇醇和和丙丙酮酮等等)，降降低低溶溶质质的的溶溶解解度度，使使其其沉沉淀淀析析出出的的分分离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。原理原理亲亲水水性性有有机机溶溶剂剂加加入入溶溶液液后后降降低低了了介介质质的的介介电电常常数数，使使溶溶质质分分子子之之间间的的静静电引力增加。电引力增加。水水溶溶性性有有机机溶溶剂剂本本身身的的水水合合作作用用降降低低了了自自由由水水的的浓浓度度，减减少少了了溶溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。特点特点 有机溶剂沉淀法的有机溶剂沉淀法的优点优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点其缺点主要是比主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。盐析更易使蛋白变性，需低温操作。4）等电点沉淀）等电点沉淀定义定义 利利用用蛋蛋白白质质在在pH等等于于其其等等电电点点的的溶溶液液中中溶溶解解度度下下降降的的原原理理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。原理原理 当当溶溶液液pH值值为为蛋蛋白白质质的的等等电电点点时时，分分子子表表面面的的净净电电荷荷为为零零，导导致致蛋蛋白白质质表表面面双双电电层层和和水水化化膜膜的的削削弱弱或或破破坏坏，分分子子间间引引力力增增加加，溶解度降低。溶解度降低。特点特点 等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。u电泳：带电颗粒在电场中移动的现电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。象。5）聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳 （1）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)u以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳。u分离机制：分离机制：电荷效应和分子筛效应电荷效应和分子筛效应+5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电+v 等等电聚焦电泳电聚焦电泳：在：在凝胶中建立凝胶中建立pHpH梯度，梯度，当蛋白质移动到当蛋白质移动到其等电点的其等电点的pHpH时，净电荷为零，在电场中不再移动而聚时，净电荷为零，在电场中不再移动而聚集。集。vIEFIEF分离蛋白质分离蛋白质靠靠分分子筛效应和电荷效应子筛效应和电荷效应，可分离，可分离pIpI仅差仅差0.010.01的蛋的蛋白质，分辨率高。白质，分辨率高。（2）等）等电聚焦电泳电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)6）亲和层析）亲和层析lgMrlgMr a ab bV Ve e4.1 凝胶过滤法测定蛋白质分子量凝胶过滤法测定蛋白质分子量依靠分子筛效应分离蛋白质，适应球状蛋白的测定依靠分子筛效应分离蛋白质，适应球状蛋白的测定4、蛋白质相对分子质量的测定、蛋白质相对分子质量的测定uSDS-PAGE：在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇，以此凝胶为支持物的电泳称为SDS-PAGE。uSDS和巯基乙醇存在的情况下，蛋白质在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子量的大小，与蛋白质本身电荷的多少和形状无关，即只有分子筛效应。4.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 4.3 沉降分析法测定相对分子量沉降分析法测定相对分子量沉降速度：与蛋白质的大小、密度、形状以及溶剂的沉降速度：与蛋白质的大小、密度、形状以及溶剂的密度和粘度相关。密度和粘度相关。Mr=RTsD(1-v)沉降系数沉降系数S用高速用高速离心机测定离心机测定Ultracentrifugation5、蛋白质的含量测定与纯度鉴定、蛋白质的含量测定与纯度鉴定5.1 5.1 蛋白质含量测定蛋白质含量测定总蛋白含量分析总蛋白含量分析：凯凯氏氏定定氮氮法法、FolinFolin-酚酚法法（LowryLowry法法）、双双缩缩脲脲法法、考考马马斯斯亮亮蓝蓝法、紫外吸收法。法、紫外吸收法。特定蛋白组分的含量分析特定蛋白组分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗体反应其它蛋白：抗原抗体反应(western blot)(western blot)5.2 5.2 纯度鉴定（均一性）纯度鉴定（均一性）基本手段基本手段：电泳分析：单条带。电泳分析：单条带。选选用用手手段段：沉沉降降分分析析、溶溶解解度度分分析析、结结晶晶分分析析（能能结结晶晶的的一一般般比较纯，具有活性）比较纯，具有活性）本章重点知识本章重点知识uu蛋白质溶液的酸碱性和等电点的大小主要与什么有关？蛋白质溶液的酸碱性和等电点的大小主要与什么有关？uu蛋白质胶体能保持稳定的主要原因。蛋白质胶体能保持稳定的主要原因。5 5种蛋白质沉淀方法的种蛋白质沉淀方法的主要原理（主要破坏蛋白质胶体的那种稳定因素）。主要原理（主要破坏蛋白质胶体的那种稳定因素）。uu凝胶过滤分离蛋白质的原理。蛋白分子量大小、分配系数和凝胶过滤分离蛋白质的原理。蛋白分子量大小、分配系数和洗脱体积三者之间的关系。洗脱体积三者之间的关系。u等电点沉淀法、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)和和SDS-SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳（胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）分离蛋白质的原理。）分离蛋白质的原理。