核酸和蛋白质分析技术.ppt

核酸和蛋白质分析技术核酸和蛋白质分析技术 第一节 核酸分析技术n讲述内容：1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片一、核 酸 电 泳 n（一）DNA的凝胶电泳n凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。1.琼脂糖凝胶用于分离大于2001000bp的片段;操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2.聚丙烯酰胺凝胶用于分离5500bp的片段;效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析 琼脂糖凝胶电泳的基本过程n材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。n基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果 n注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度（，（，W/V)DNA分子的有效分离范围（分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：n1 DNA分子的大小n2 构象n3 凝胶浓度n4 电压n5 缓冲液琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成PCR产物的琼脂 糖电泳 聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析特殊的凝胶电泳n倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分离分子量102000kb的DNA分子；n钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可分离大于107bp的DNA分子 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。（二）RNA 电 泳二 核酸杂交技术n（一）Southern Blotn原理：原理：将待检测的将待检测的DNA分子用分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的记的DNA或或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。其相对大小。用途：检测样品中的用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态及其含量，了解基因的状态,如是否有如是否有点突变、扩增重排等。点突变、扩增重排等。Southern Blot 操作步骤：操作步骤：DNA 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 印迹转移印迹转移 预杂交预杂交 杂交（变性探针）杂交（变性探针）洗膜洗膜 放射自显影或显色放射自显影或显色n原原理理：在在变变性性条条件件下下将将待待检检的的RNA样样品品进进行行琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，继继而而按按照照同同Southern Blot相相同同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。n用用途途：检检测测样样品品中中是是否否含含有有基基因因的的转转录录产产物物（mRNA）及其含量。及其含量。（二）（二）Northern Blot 操作过程操作过程 mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针）洗膜 放射自显影或化学发光（三）探针标记技术（三）探针标记技术n1 标记物标记物：放射性和非放射性两种n放射性：n非放射性：生物素生物素、地高辛素、荧光素 n2、标记方法、标记方法 n（1）切口平移法 n（2）随机引物法n（3）末端标记法n（4）单链DNA探针标记n（5）寡核苷酸探针标记法 32P、35S和和3H三 PCR技术nPCR(Polymerase chain reaction)是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性退火DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经2530个循环后，扩增倍数可达106。nDr.Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；目的目的:用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。（一）原理：（一）原理：双链双链DNA通过高温变性解离成互补单链通过高温变性解离成互补单链DNA变性变性与一对寡核苷酸引物（与一对寡核苷酸引物（5，3）降低温度退火）降低温度退火DNA加热变性加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火退火适温延伸适温延伸5/3引物形成新链变成引物形成新链变成4条链条链DNA延伸延伸第二轮：变性第二轮：变性退火退火延伸延伸呈指数增长呈指数增长理论值：一轮一倍理论值：一轮一倍10轮轮103=1000倍倍20轮轮10630轮轮109理论理论模板扩增模板扩增30轮轮1ng-1g实际实际模板扩增模板扩增30轮轮1ng-10 gn1 Taq DNA聚合酶聚合酶：n 水生栖热菌水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的的DNA聚合酶聚合酶n 53DNA聚合酶活性；聚合酶活性；n 无无35外切酶活性外切酶活性，n 35轮轮0.25%错配错配，与原始模板有差别；与原始模板有差别；n 最适聚合酶最适聚合酶 温度温度72，选择，选择72延伸延伸n 半衰期：半衰期：92.5 130min n 95 40min n 97.5 56minn 变性温度：变性温度：95使其在整个扩增循环中保持足够活性使其在整个扩增循环中保持足够活性（二）基本要素（二）基本要素pfu DNA 聚合酶n耐热n53DNA聚合酶活性聚合酶活性n35外切酶活性n精确度：pfu Taq 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差n文献报道：文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果会起到较好效果n n 2.引物n 人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-60，n Tm值要相近，每条10-50pmol/100l n 设计原则：（1）靠近5上游Primer与双链DNA正链相同n 3下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同n 正链5 3 上游Primern 下游Primer 负链 3 5n 例如：n IL-3正链n 5GCTCCATGACCCAG-GCGATCTTTTGAGTCCAA 3n 负链3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5n 上游：与其相同n 下游：先写出相应负链35然后倒过来53n 所以负链Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC-3（2）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如：GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer一般不要超过3个互补bp如：CCCATGCATGGAGTC:GGGTCTATCAGTAAGCn n n 修饰修饰n 如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果n 突变：突变：n AGCTCCATGACCCAG n 5CGCTCCATGACCCAG 3n 注意：绝不可以在注意：绝不可以在3端进行上述改造端进行上述改造n DNA聚合酶是53聚合，若3端改造不能互补不能延伸n （4）Primer 5未端可修饰、突变:n （5 5）primer 5primer 5端增加碱基端增加碱基n n n 内切酶识别点内切酶识别点：n （G）GAATTC GCTCCATGACCCAG n 保护bpn 对PCR产物cloning有很大好处n 便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同n EcoRI 1 BglII 2-3n XbaI 2-3 Hind 3n BamHI 2-3 PstI 4n XhoI 4 NotI 10n 如果所用保护bp数量不合适影响内切酶消化影响下步克隆n 未切开，连接不上n ATG起始密码TAA、TAG、TGA终止密码如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。3.3.模板模板：可选可选：DNA mRNA逆转录cDNA DNA包括：质粒 噬菌体 染色体DNA 较小 较大 目的gene是单拷贝 变性较易 变性较难 非常大，变性难 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意：防止交叉污染4.dNTP4.dNTP：四种脱氧核苷酸，四种脱氧核苷酸，基本原料基本原料终浓度：终浓度：5050 M M 注意：不稳定，保存时间长会失效注意：不稳定，保存时间长会失效 5.Mg2+TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+不同的酶需不同Mg2+Taq：较少，Mg2+对反应影响很大，终浓度 pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍 外界影响外界影响：EDTA鳌合Mg2+选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)；DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+有效浓度。如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的 Mg Mg2+2+浓度浓度 （1）变性温度：94-95 Templete：GC比例高、长度很长，则变性T （2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm退火T；Tm退火T若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：500nt-1min 500nt3min一般：4060sec 6.温度和时间：（三）PCR技术的应用n1.基因检测：n2.基因克隆化n3.DNA突变n4.DNA序列分析 四、基因芯片四、基因芯片n利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究背景资料背景资料基因芯片（）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条探针。由于芯片上有序地排列着探针，因此也被称为微阵列（）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（或）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。操作流程操作流程 n（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）；n（2）靶基因样品的制备；n靶基因的制备：RT-PCR（设实验组和对照组）n标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5n（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似n封闭预杂交杂交洗脱n（4）杂交信号的检测与结果的分析n激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析n 基因芯片的应用n用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究 举例：美国斯坦福大学Davis等用PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了1046种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的T淋巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证实，其中3个是未报导的新基因。第二节 蛋白质分析技术n讲述内容：一、一、Western Blot 二、二、ELISA三、免疫荧光技术三、免疫荧光技术四、免疫组织化学技术四、免疫组织化学技术 五、五、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术一 Western Blotn1 1 原理原理：n将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。2 操作过程nSDS-PAGE电泳电泳 转膜（转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）或硝酸纤维素膜）n封闭封闭 一抗一抗 洗涤洗涤 酶标二抗反应酶标二抗反应n洗涤洗涤 显色或化学发光显影显色或化学发光显影Hours04816WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3.IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20M of gossypol for 4,8 and 16 h.After treatment,cells were harvested and lysed in lysis buffer.50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control0h4h8h16hWestern Blot analysis of cytochrome C release.Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells.Cells were treated with 10M gossypol for different times,cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.Cyto-CX-Protein3 注意的问题n（1）蛋白质电泳n常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质n非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质nTris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套（2）转膜n戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致n以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜1530min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。n方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极n排去滤纸、胶和膜间的气泡。n电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择n转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率n膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置（3）封闭n用5脱脂奶粉或3BSAn（含（含0.1Tween20 TBS或或PBS配制）配制）n时间：室温2h或4C过夜（4）显色或显影n显色n辣根过氧化物酶：底物为DABn碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBTn化学发光显影化学发光显影n最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）n注意：化学发光前将膜用不含注意：化学发光前将膜用不含Tween20的的TBS或或PBS洗涤一次洗涤一次n 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定（5）膜的再利用n化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer:62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2SDS和100mm的 2ME）用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用34次。n碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交n 1 原理：nELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。二、ELISAELISA 常用的酶和底物常用的酶和底物n辣根过氧化物酶，底物为辣根过氧化物酶，底物为OPD,深桔黄色深桔黄色，检测波长，检测波长492nmn TMB，蓝绿色，检测波长蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为碱性磷酸酶，底物为PNPP（对消基苯磷酸酯）（对消基苯磷酸酯）,黄色黄色 检测波长检测波长405nm ELISA各步骤的反应时间各步骤的反应时间 包被：包被：2436h，蛋白浓度为，蛋白浓度为15ug/ml 封闭：封闭：37C 2h 或或4C过夜（过夜（3BSA）样本反应时间：样本反应时间：37C 45min-1h 酶标抗体反应时间：酶标抗体反应时间：37C 45min-1h 显色时间：显色时间：15min(避光）避光）设对照设对照 可以一次包被多块板，冻存备用可以一次包被多块板，冻存备用 2 类型（1）间接法测抗体）间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗 体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。方法：方法：抗原包被 封闭 待检抗体 洗涤 酶标二抗 洗涤 显色反应 终止反应 ELISA Reader检测 OD值(2)双抗体夹心法测抗原n是检测抗原最常用的方法。是检测抗原最常用的方法。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。固相载体和制备酶结合物。常用的组合：常用的组合：单克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。酶结合物。用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用 于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成 两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。n双抗体夹心法测抗原的方法：双抗体夹心法测抗原的方法：捕获抗体包被 封闭（3BSA）待测抗原 洗涤（含0.1Tween的PBS)酶标单抗或多抗 洗涤 显色 检测(3)竞争法测抗原n1）抗体固相测抗原）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。n其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。n方法：方法：抗体包被 封闭 同时加入待测抗原和酶标抗原n 洗涤 酶底物 显色 ELISA reader检测n2）抗原固相测抗原其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。方法:a:抗原包被96孔板；b:封闭;c:待测抗原与抗体反应一定时间；d:加入96孔板 e:洗涤 f：加入酶标二抗 g：洗涤 h：显色和检测如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测（4）IgM抗体的检测抗体的检测1 1）间接法）间接法：间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。方法方法 a:抗原包被96孔酶标板；b:封闭;c:待测血清与A蛋白反应一定时间后离心 d:吸取上清液加入96孔酶标板 e:洗涤 f：加入酶标抗IgM的抗体 g：洗涤 h：显色和检测2）捕获包被法（夹心法）捕获包被法（夹心法）先用抗人IgM抗体包被ELISA板，以捕获血清标本中的IgM（包括针对抗原特异性的IgM和非特异性的IgM)。然后加入相应抗原，继而加入针对抗原特异的酶标抗体，再与底物作用，颜色的深浅即与标本中的IgM含量成正相关。方法：a:抗人IgM抗体包被96孔酶标板；b:封闭;c:加入待测血清；d:洗涤96孔酶标板 e:加入相应抗原 f：加入抗原特异的酶标抗体 g：洗涤 h：显色和检测（5）ABS-ELISA技术 （Avidin Biotin system-ELISA原理原理亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。操作过程：操作过程：抗原包被 封闭 待检标本 生物素化抗体 洗涤 酶标记亲和素 洗涤 加底物显色和检测 三 免疫荧光技术免疫荧光技术 n利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。（一）细胞膜蛋白分子的检测n原理：n细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量n1 直接法直接法：细胞荧光素标记的抗CD分子的抗体 4C反应30-60min 荧光显微镜观察或流式细胞计分析。n2 间接法间接法：细胞抗CD分子的抗体 4C 反应30-60min 荧光素标记的二抗 4C 反应30-60min 荧光显微镜观察或流式细胞计分析悬浮细胞：用PBS洗二次后再做染色贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色1 细胞膜细胞膜CD分子的检测分子的检测 2 Annexin V检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标)n磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。原理原理样本处理和染色方法1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.51106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。（二）细胞内蛋白分子的检测细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。操作过程：操作过程：（1）直接法：细胞 3多聚甲醛固定和 渗透化 封闭 荧光素标记的 抗体 洗涤 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 （2）间接法：细胞 3多聚甲醛固定和渗透化 封闭 针对蛋白的特异 抗体 洗涤 荧光素标记的二抗 洗涤 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 nTFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。n1 悬浮细胞的染色：悬浮细胞的染色：（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.51106），PBS洗2次，（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm10min。（3）加入PBS-T溶液，37C孵育15min，PBS洗2次，n（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。（5）加入 FITC标记的TFAR19单抗，4C反应30min（6）荧光细胞洗液洗2次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。2：贴壁细胞的原位染色：贴壁细胞的原位染色（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ul）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。n原理：n是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。四免疫组织化学技术免疫组化染色技术的分类n免疫荧光法（Immunofluorescence technique）n免疫酶法（Immunoperoxidase technique）n免疫金银法（Immunogold technique）nABC法（Avidin-Biotin Complex）五五 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术1 GST融合蛋白进行融合蛋白进行Pulldow实验实验 （1）原理）原理 细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。两种应用：两种应用：1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 （2）方法：）方法：1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4C 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS-PAGE电泳，6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白 该实验设立GST对照，反应均在4C进行GST-Pulldown Assay2 免疫共沉淀n（1）原理）原理n当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档n缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题（2）方法n1)收获培养的细胞（11071108）冷PBS洗涤2次n2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30minn3)12000rpm 离心 30minn4）收集上清并加入适量抗体，4C摇动1hn5）加入ProteinG-Sepharose悬液，4C摇动1hn6）细胞裂解液洗涤ProteinG-Sepharose混合液n7）离心弃上清n8）沉淀加2蛋白LoadingBuffer煮沸510minn9）离心，上清液跑SDS-PAGE胶n10）考马氏亮兰染色、银染nWesternBlot质谱分析（3）注意的问题）注意的问题n1）细胞裂解n采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质 相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的剂，如商品化的cocktailer。n2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用n3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgGn n（1）原理：n将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。3 酵母双杂交系统酵母双杂交系统双双杂杂交交系系统统的的原原理理LacZGal4激活域Gal4结合域Gal4结合域LacZLacZGal4激活域LacZGal4激活域Gal4结合域XYXY 1）已知蛋白之间相互作用的检测：2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。用途用途4 蛋白质芯片n其制作原理类似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的样品是提纯的蛋白、多肽。其检测的原理类似于抗原、抗体检测的ELISA法。如采用双抗夹心的形式，可通过机械点涂的方法，将多种不同的单克隆抗体点样固定在固相介质表面，如PVDF膜上，制备成抗体蛋白芯片，与制备的多种抗原样本杂交、结合，芯片上的抗体捕获相应的抗原，然后再与标记的多种不同的抗体杂交，由于抗原具有多价结合表位而结合标记抗体，根据杂交信号的有无、多少而进行定性、定量的分析。