核酸分子杂交技术与核酸序列测.ppt

第七章第七章 核酸分子杂交技术与核酸核酸分子杂交技术与核酸序列测定序列测定Molecular Hybridization and Blotting Technology 主讲教师：主讲教师：熊伟熊伟 副教授副教授/博士博士Content of Table 前前 言言1 1 核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理2 2 核酸探针的制备核酸探针的制备3 3 核酸探针的标记核酸探针的标记4 4 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术前前言言 核酸分子杂交核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性变性DNADNA或或RNARNA单链，经退火处理形成单链，经退火处理形成DNA-DNADNA-DNA或或DNA-RNADNA-RNA这一过程叫这一过程叫分子杂交分子杂交。第一节第一节核酸分子杂交的核酸分子杂交的基本原理基本原理（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridizationnucleic acid hybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子之间形成子之间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理P44P44复性复性RNADNA1.原理原理DNA的变性与复性的变性与复性2.常见条件：加热常见条件：加热S形曲线形曲线解链温度（解链温度（Tm）A260260增高的原因增高的原因3.分子杂交的目的分子杂交的目的 应应 用：用：(1)(1)检测特定生物有机体之间是否存在检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；亲缘关系；(2)(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。的存在与否、拷贝数及表达丰度。HomeDNADNA变性的本质是双链间变性的本质是双链间氢键氢键的断裂的断裂例：例：变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液A260增高的现象。增高的现象。热变性热变性解解链链曲曲线线：如如果果在在连连续续加加热热DNADNA的的过过程程中中以以温温度度对对A A260260（absorbanceabsorbance，A A，A A260260代代表表溶溶液液在在260nm260nm处处的的吸吸光光率率）值值作作图图，所所得得的的曲曲线线称称为为解解链曲线链曲线。Tm：变变性性是是在在一一个个相相当当窄窄的的温温度度范范围围内内完完成成，在在这这一一范范围围内内，紫紫外外光光吸吸收收值值达达到到最最大大值值的的50%时时的的温温度度称称为为DNA的的解解链链温温度度，又又称称融融解解温温度度(melting temperature,Tm)。其其大大小小与与G+C含量成正比。含量成正比。DNADNA的复性与分子杂交的复性与分子杂交 DNA复性复性(renaturation)的定义的定义在适当条件下，变性在适当条件下，变性在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNADNADNA的两条互补链可的两条互补链可的两条互补链可的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性复性复性。热变性的热变性的热变性的热变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为这一过程称为这一过程称为退火退火退火退火(annealing)(annealing)。复性条件：复性条件：Tm50C4度以下几乎不复性度以下几乎不复性核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置鉴定两种核酸分子间的序列相似性鉴定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 第二节第二节 核酸探针技术及其标记核酸探针技术及其标记 探针探针探针探针(probe)P46(probe)P46经经经经过过过过特特特特殊殊殊殊标标标标记记记记的的的的核核核核酸酸酸酸片片片片段段段段，具具具具有有有有特特特特定定定定的的的的序序序序列列列列，能能能能够够够够与与与与待待待待测测测测的的的的核核核核酸酸酸酸片片片片段段段段互互互互补补补补结结结结合合合合，因因因因此此此此可可可可用用用用于于于于检检检检测核酸样品中的特定基因。测核酸样品中的特定基因。测核酸样品中的特定基因。测核酸样品中的特定基因。一、核酸探针的种类和应用一、核酸探针的种类和应用根据核酸性质和检测目的不同可以分为：（一）基因组DNA探针（二）cDNA探针（三）RNA探针（四）人工合成的寡核苷酸探针最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之间在核酸序列上要有高度的特异性基因组基因组DNA探针探针真核生物基因组中存在大量的重复序列和非编码序列，因此选择基因组DNA做探针时，一定要充分考虑实验目的性利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段特定的DNA序列cDNA探针探针cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产生的。利用基因克隆的方法可获得cDNA优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其适用于基因表达的检测。RNA探针探针RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA杂交，可以反映出基因的转录状态。人工合成的寡核苷酸探针人工合成的寡核苷酸探针利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成寡核苷酸探针设计寡核苷酸探针的原则设计寡核苷酸探针的原则1）序列及长度 根据靶分子的序列而定，长度一般为18-50个核苷酸合适。2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60%3）探针分子内不存在互补，避免出现“发夹”结构4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个5）与非靶标区域的同源性不超过70%二、探针的标记二、探针的标记探针标记方法探针标记方法探针标记方法探针标记方法:放射性和非放射性两种放射性和非放射性两种放射性核素：放射性核素：32P、35S和和3H非放射性标记物：非放射性标记物：1）半抗原：）半抗原：生物素、地高辛素生物素、地高辛素抗原抗原-抗体反应抗体反应2）配体：生物素）配体：生物素-亲和素反应亲和素反应3）荧光素）荧光素(FITCFITC、罗丹明、罗丹明、罗丹明、罗丹明)4 4）化学发光探针）化学发光探针）化学发光探针）化学发光探针 探针标记方法探针标记方法核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标记，分为化学法和酶法化学法化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。酶法酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。一个理想的标记物应满足：(1)(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同标记前后探针基本结构、化学性质相同;(2)(2)特异性强、本底低、重复性好；特异性强、本底低、重复性好；(3)(3)操作简单、节时；操作简单、节时；(4)(4)安全、无环境污染。安全、无环境污染。常用探针的标记方法常用探针的标记方法 缺口平移法缺口平移法 随机引物标记法随机引物标记法 末端标记法末端标记法 生物素光照标记法生物素光照标记法缺口平移法的原理缺口平移法的原理 将将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的的53的聚合酶活性和的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。的外切酶活性相结合。首先用首先用E.coli的的DNAse I 在探针在探针DNA双链上造成缺口，然双链上造成缺口，然后再借助于后再借助于DNA pol I的的53外切酶活性，切去带有外切酶活性，切去带有5-磷磷酸的核苷酸；同时利用该酶酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，方向移动，DNA链链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。探针。随机引物标记法原理随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针引物和探针DNADNA片段一起热变性，退火后，片段一起热变性，退火后，引物与单链引物与单链DNADNA互补结合，再在互补结合，再在DNADNA聚合酶的聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其作用下，按碱基互补配对原则不断在其3-3-OHOH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。的标记的探针片段。末端标记法原理末端标记法原理（1）一种是在）一种是在5末端加成标记法：末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（先用碱性磷酸酶（AP）去掉）去掉dsDNA 5-磷磷酸，再用酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的多核苷酸激酶催化标记的ATP 的的-磷酸转移加到磷酸转移加到DNA片段片段5-OH上。上。（2）在探针）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个末端用末端转移酶掺入一个单标记的单标记的-32PdNTP。生物素光照标记法生物素光照标记法 光敏生物素在紫外线照射下与光敏生物素在紫外线照射下与DNADNA或或RNARNA的碱基发生化学加成反的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的应，获得生物素标记的DNADNA探针。探针。探针的纯化探针的纯化 1.乙醇沉淀法 用无水乙醇沉淀2-3次2.SG-50柱层析法3.微柱离心法第三节第三节核酸分子核酸分子杂交的基本方法杂交的基本方法核酸分子杂交根据被分析样品的性质核酸分子杂交根据被分析样品的性质不同，分为：液相杂交和固相杂交。不同，分为：液相杂交和固相杂交。固相杂交：固相杂交：液相中的核酸探针与位于固相支持物上液相中的核酸探针与位于固相支持物上的待测核酸片段进行杂交的过程。的待测核酸片段进行杂交的过程。分为：分为：原位杂交原位杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交将通过凝胶电泳分离的核酸将通过凝胶电泳分离的核酸片段片段转移转移到特定的固相支持物上到特定的固相支持物上,在在转移过程中，核酸片段保持其原来转移过程中，核酸片段保持其原来的相对位置不变，然后采用标记的核的相对位置不变，然后采用标记的核酸酸探针探针与结合于固相支持物上核酸片与结合于固相支持物上核酸片段进行段进行杂交杂交的技术。的技术。印迹杂交类别：印迹杂交类别：（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southernblotting)（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northernblotting)（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用 （一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析、重组质粒和噬菌体的分析。从组织或细胞中从组织或细胞中提取提取基因组基因组DNA限制性内限制性内切切酶酶消化消化琼脂糖脂糖凝胶凝胶电泳电泳将将DNA按大小分按大小分离离含有含有DNA区区带的凝胶在的凝胶在变性溶液中性溶液中变性性DNA变性后从变性后从凝胶凝胶转移转移到固相支持物上到固相支持物上特异性探特异性探针与固着于膜上的与固着于膜上的DNA杂交交杂交交结果反映待果反映待测核酸核酸样品的有关品的有关基因信息基因信息。分子杂交实验分子杂交实验白瓷盘白瓷盘玻玻璃璃板板滤滤纸纸凝胶凝胶尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板重物重物吸水纸转膜吸水纸转膜。真空转膜槽真空转膜槽滤滤纸纸尼尼龙龙膜膜凝胶凝胶盖子盖子+-真空转膜真空转膜Southern印迹法印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern和和Western印迹法印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northernblotting)(Northernblotting)基本过程与基本过程与Southernblotting相似。相似。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)(Westernblotting)将待检测蛋白质（或酶）经将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体抗体-抗抗原原”免疫反应或免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。别滤膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量及用于蛋白质定性定量及相互作用研究相互作用研究。常用常用Ab来检测蛋白质，也被称为来检测蛋白质，也被称为免疫免疫印迹技术印迹技术。靠靠电转移电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。将蛋白质从凝胶转移到膜上。实验操作实验操作1细胞裂解物的准备；细胞裂解物的准备；2细胞裂解物的蛋白定量；细胞裂解物的蛋白定量；3细胞裂解物的细胞裂解物的SDS-PAGE；4蛋白质的转移；蛋白质的转移；5目的蛋白质的检测。目的蛋白质的检测。蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照照片片(四四)斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting 适于核酸样品定量检测，而不是适于核酸样品定量检测，而不是定性检测。定性检测。(五五)原位杂交原位杂交in situhybridization分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交 第第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析NucleicAcidSequenceAnalysis 基因测序基因测序是确定是确定DNADNA双股链上每个独立结构单元或碱基的双股链上每个独立结构单元或碱基的确切顺序的过程。测序经常被称为确切顺序的过程。测序经常被称为“破译破译”，因为其结果就像，因为其结果就像解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行解码一样。解码结果包含数百页和成千上万行4 4种字母的序列。种字母的序列。这些字母表示这些字母表示4 4种不同的碱基，分别用它们的首字母种不同的碱基，分别用它们的首字母A A、T T、C C、GG表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生命指表示，其排列顺序中蕴藏着各种各样的遗传信息和生命指令。令。生物信息学生物信息学(bioinformation)(bioinformation)是一门伴随着基因组研究而是一门伴随着基因组研究而产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关的产生的交叉学科。广义地说，它是从事与基因组研究有关的生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门学生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和解释的一门学科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理以科。这个定义包含两层意思，即对海量数据的收集、整理以及对这些数据的应用。及对这些数据的应用。核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法(sanger法法)DNA测序的基本战略测序的基本战略 设设法法产产生生带带标标记记的的不不同同长长度度的的成成套套DNA片片段段，各各带带有有标标记记的的片片段段起起点点相相同同、终终点点不不同同，使使待待测测的的DNA链链中中的的相相应应每每个个核核苷苷酸酸处处都都有有断断裂裂或或终终止止。通通过过PAGE电电泳泳，能能够够将将相相差差一一个个核核苷苷酸酸的的DNA片片段段分分开开，放放射射自自显显影影后后，根根据据长长短短排排列列，根根据据特特定定末末端端碱碱基基的的DNA片片段段就就可可读出待测读出待测DNA的碱基序列。的碱基序列。酶法酶法 测序技术进展测序技术进展DNA序列分析序列分析（一）（一）双脱氧终止法双脱氧终止法英英国国Sanger1955确确定定牛牛胰胰岛岛素素结结构构,1958获获诺诺贝贝尔尔化化学学奖奖1975设设计计出出DNA测测序序法法,1980获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖.合成一段与待测合成一段与待测DNA序列互补的序列互补的DNA片段群。片段群。DNA的的Sanger测序法测序法(酶法酶法)读出模板互读出模板互补序列补序列dNTP 凝胶电泳凝胶电泳 较大片段较大片段 较小片段较小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物反应混合物Klenow酶酶 未知序列的单链未知序列的单链DNA 读出待测读出待测序列序列CTGACTTCGACAAAGAA53 放射性标记的引物放射性标记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT35CTGACTTCGACAA53DNA的测序仪示意图的测序仪示意图computer analysis凝胶中凝胶中DNA移动方向移动方向样品槽样品槽激光器激光器输入光学系统输入光学系统成象透镜成象透镜聚焦透镜聚焦透镜高灵敏度相机高灵敏度相机旋光镜旋光镜/棱镜组件棱镜组件测序技术进展测序技术进展同位素标记到荧光标记同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记多色荧光标记毛细管电泳毛细管电泳单色荧光标记单色荧光标记平板电泳平板电泳同位素标记同位素标记平板电泳平板电泳A C G TA C GT测序图谱测序图谱TATTGCATTGTCTGCATTGTCT三、三、DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧光信号，并依此确定荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。MOV:MCB4.0Dideoxy sequencing of DNADNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTPDNA自动测序结果举例