核酸化学生物化学.ppt

第二章核酸化学第一节 概述第二节 核酸的化学组成第三节 核酸的分子结构第四节 核酸的性质第五节 核酸的研究方法本章内容本章内容第一节第一节概 述 核酸（核酸（nucleic acidNA）是一类重要是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。心分子。1868 F.Miescher从从脓脓细细胞胞的的细细胞胞核核中中分分离离出出了了一一 种种含含磷磷酸酸的的有有机机物物，当当时时称称为为核核素素（nuclein）,后后称称为为核核酸（酸（nucleic acid）。1944 Avery 等等通通过过肺肺炎炎球球菌菌转转化化试试验验证证明明DNA是是遗遗传传物质。物质。1952 Hershey,Chase-噬菌体标记实验。噬菌体标记实验。1953 Watson和和Crick提出提出DNA结构的双螺旋模型。结构的双螺旋模型。1958 Crick提出遗传信息传递的中心法则。提出遗传信息传递的中心法则。1973 Boyer，Cohen-DNA Cloning(克隆）。克隆）。1976 DNA Sequencing(序列分析）。序列分析）。1990 Human Genome Project（人类基因组计划）。（人类基因组计划）。一、核酸的研究历史1944年年Avery细菌转化实验细菌转化实验肺炎病菌有二种，一种是光滑型肺炎双球菌：有荚膜、菌落光滑且有毒。这种菌通常外包有一层黏性发光的多糖荚膜，它是细菌致病性的必要成分，引起肺炎；另一种是粗糙型肺炎双球菌：无荚膜、菌落粗糙且无毒。（a）将光滑型肺炎双球菌注入小鼠体内，使小鼠致死。（b）将粗糙型肺炎双球菌注入小鼠体内，对小鼠无害。（c）将光滑型肺炎双球菌加热杀死后，再注入小鼠体内，对小鼠无害。（d）将加热杀死的光滑型肺炎双球菌与粗糙型肺炎双球菌一起注入小鼠体内，小鼠死掉。这说明粗糙型肺炎双球菌变成了致死的光滑型肺炎双球菌。暗示着被杀死的光滑型肺炎双球菌中含有某种因子，它进入了粗糙型肺炎双球菌将它转化成了致死的光滑型肺炎双球菌。（e）从加热杀死的光滑型肺炎双球菌中提取DNA，并且尽可能地将混在DNA中的蛋白质除去，然后将除去了蛋白质的DNA与粗糙型肺炎双球菌混合后，再注入小鼠体内，小鼠死掉。1928年细菌学家年细菌学家Griffith 细菌毒性实验细菌毒性实验 1952年美国年美国Hershey 噬菌体感染实验噬菌体感染实验 DNA的遗传作用的进一步证明是来自A.Hershy和M.Chase的噬菌体感染大肠杆菌的研究。用放射性同位素32P标记噬菌体DNA，使标记的噬菌体感染大肠杆菌，经短期保温后，噬菌体就附着在细菌上。然后用搅拌器（10000转/分）搅拌几分钟，使噬菌体与大肠杆菌分开，再用高速离心机使细菌沉淀，分析沉淀和上清中的放射性（右图）。用35S标记噬菌体的蛋白质外壳，进行同样的验证实验。实验结果是大多数噬菌体的DNA存在于细菌中，而外壳留在上清中。但是被感染的细菌内部出现了奇迹。随着被感染的细菌的培养，有的细菌破裂，释放出很多噬菌体来。这说明用于复制的遗传信息通过病毒DNA，而不是通过病毒蛋白质导入细菌内的。真核生物真核生物 原核生物原核生物 细细胞核（胞核（98%98%）拟核拟核 线线粒体粒体mDNAmDNA （少量）（少量）质质粒粒DNADNA（plasmidplasmid）叶叶绿绿体体ctDNActDNA （少量）等（少量）等 病毒病毒DNADNA 细细胞胞质质（90%90%）细细胞胞质质 核仁（少量）核仁（少量）病毒病毒RNARNA 二、核酸的种类和分布二、核酸的种类和分布 DNA DNA脱氧核糖核酸 RNA RNA核糖核酸注：生物细胞都含有注：生物细胞都含有DNA DNA 和和 RNA RNA；病毒中只含病毒中只含 DNA DNA 或或 只含只含 RNA RNA。第二节第二节核酸的化学组成 核酸核酸是由几十个甚至几千万个是由几十个甚至几千万个核苷酸核苷酸聚合而成的聚合而成的具有一定空间结构具有一定空间结构的的生物大分子生物大分子。基本元素：基本元素：C、H、O、N、P；其中其中P 的含量比较稳定，占的含量比较稳定，占9%-10%，通过测，通过测定定P 的含量来推算核酸的含量（定磷法）。的含量来推算核酸的含量（定磷法）。磷酸磷酸 核苷核苷 碱基碱基 戊糖戊糖 核酸核酸核苷酸核苷酸 一、一、戊糖戊糖 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。二、碱基二、碱基1.嘌呤（嘌呤（Purine）腺嘌呤腺嘌呤AdenineA A 鸟嘌呤鸟嘌呤guanineGG2.嘧啶（嘧啶（Pyrimidine）胸腺嘧啶胸腺嘧啶T胞嘧啶胞嘧啶C尿嘧啶尿嘧啶U 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。二氢尿嘧啶二氢尿嘧啶 （DHU）修饰碱基的简写符号修饰碱基的简写符号(为为1时可以不写时可以不写)三、核苷（三、核苷（nucleoside）核苷：戊糖核苷：戊糖+碱基碱基 糖与碱基之间的糖与碱基之间的C-NC-N键，称为键，称为C-NC-N糖苷键糖苷键核苷中戊糖与碱基的连接方式：核苷中戊糖与碱基的连接方式：1122334455(OH)1122334455(OH)修饰核苷修饰核苷/稀有核苷稀有核苷修饰核苷包括三种情况修饰核苷包括三种情况:（1）由）由修饰碱基修饰碱基和糖组成的核苷和糖组成的核苷（2）由非修饰碱基和）由非修饰碱基和2-O-甲基核糖甲基核糖组成的核苷组成的核苷（3）由碱基与糖）由碱基与糖连接方式特殊连接方式特殊的核苷的核苷（1）（2）二氢尿嘧啶核苷二氢尿嘧啶核苷 (Am)（3）()取代基用下列小写英文字母表示取代基用下列小写英文字母表示:甲基甲基m 乙酰基乙酰基ac 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羟基羟基o或或h 硫基硫基s 异戊烯基异戊烯基i 羧基羧基c 例：例：四、核苷酸（四、核苷酸（nucleotide）核苷酸：核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸H五、游离核苷酸及其衍生物的形式五、游离核苷酸及其衍生物的形式1.1.继续磷酸化继续磷酸化2.2.环化磷酸化环化磷酸化 cAMP cGMP3.3.辅酶辅酶 NAD、NADP、FAD、HSCoAFADNAD、NADPHSCoA4.GDP-4.GDP-半乳糖、半乳糖、GDP-GDP-葡萄糖等是糖蛋白葡萄糖等是糖蛋白 生物合成和多糖生物合成的活性糖生物合成和多糖生物合成的活性糖 基供体。基供体。第三节第三节 核酸的分子结构核酸的分子结构 一、一、DNA的结构的结构一级结构一级结构:DNA核苷酸链中脱氧核苷核苷酸链中脱氧核苷 酸的组成和排列顺序。酸的组成和排列顺序。二级结构：二级结构：DNA的两条多聚链间通过的两条多聚链间通过 氢键形成的双螺旋结构。氢键形成的双螺旋结构。三级结构：三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲双链进一步折叠卷曲 形成的构象。形成的构象。（一）（一）DNADNA的一级结构的一级结构 由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP核苷酸单体通核苷酸单体通过过3,5-3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。5533结构式结构式l5-5-磷酸端（常用磷酸端（常用5 5-P-P表示）；表示）；3 3-羟基端（常羟基端（常用用3 3-OH-OH表示）表示）l核苷酸链具有方向性，当核苷酸链具有方向性，当表示一个核苷酸链时，必表示一个核苷酸链时，必须注明它的方向是须注明它的方向是5353或是或是3535。字母式字母式5PAPCPGPCPTPGPTPAOH 3 5 PACGCTGTAOH 3线条式线条式OHDNA的一级结构也可指的一级结构也可指DNA分子中碱基的顺序。分子中碱基的顺序。DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于式。生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。核苷酸千变万化的不同排列组合之中。（二）（二）DNA的二级结构的二级结构qWatson Watson 和和 Crick Crick 于于19531953年提出年提出了了DNA DNA 双螺旋结构模型，说明了双螺旋结构模型，说明了DNA DNA 的二级结构。（即的二级结构。（即B B型型DNADNA）（1 1）ChargaffChargaff定则定则 （1950s,E.Chargaff1950s,E.Chargaff发现）发现）I.I.DNADNA碱基组成符合：碱基组成符合：A=TA=T；G=CG=C；A+G=T+CA+G=T+C。II.II.不对称比率：不对称比率：A+T/G+CA+T/G+C；III.III.物种不同，物种不同，DNADNA碱基组成不同；碱基组成不同；IV.IV.物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，物种亲缘愈接近，碱基组成也愈接近，该比该比V.V.率越相近似。率越相近似。VI.VI.具有种的特异性，没有器官和组织的特具有种的特异性，没有器官和组织的特异性，年龄、营养状况、环境的改变不影响异性，年龄、营养状况、环境的改变不影响DNADNA的碱基组成。的碱基组成。1提出提出DNA双螺旋结构模型的根据双螺旋结构模型的根据（2）x-光衍射分析 20世纪40年代Astbury 1952年M.Wilkins 2DNA双螺旋结构模型（双螺旋结构模型（double-helical structure）1953年年Watson和和Crick提出了提出了DNA双螺旋结构。双螺旋结构。DNADNA双螺旋结构模型要点（双螺旋结构模型要点（1 1）q螺旋中的两条链螺旋中的两条链反向平行反向平行，即其中一条即其中一条链的方向为链的方向为5353，而另一条链的方，而另一条链的方向为向为3535，两条链共同围绕一个假，两条链共同围绕一个假想的中心轴呈想的中心轴呈右手双螺旋右手双螺旋结构。结构。DNADNA双螺旋结构模型要点（双螺旋结构模型要点（2 2）q疏水的碱基位于双螺旋的内侧，亲水疏水的碱基位于双螺旋的内侧，亲水的磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。的磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基平面与螺旋轴垂直，脱氧核糖平碱基平面与螺旋轴垂直，脱氧核糖平面与中心轴平行。面与中心轴平行。q由于几何形状的限制，碱基对只能由由于几何形状的限制，碱基对只能由嘌呤和嘧啶配对，嘌呤和嘧啶配对，即即A A与与T T，G G与与C C。这这种配对关系，称为种配对关系，称为碱基互补碱基互补。A A和和T T之之间形成两个氢键，间形成两个氢键，G G与与C C之间形成三个之间形成三个氢键。氢键。T-A碱基对碱基对C-G碱基对碱基对DNADNA双螺旋结构模型要点（双螺旋结构模型要点（3 3）q由于碱基对排列的方由于碱基对排列的方向性，使得碱基对占向性，使得碱基对占据的空间是不对称的，据的空间是不对称的，因此，在双螺旋的表因此，在双螺旋的表面形成大小两个凹槽，面形成大小两个凹槽，分别称为分别称为大沟和小沟，大沟和小沟，二者交替出现。二者交替出现。2.0 nm小小沟沟大大沟沟DNADNA双螺旋结构模型要点（双螺旋结构模型要点（4 4）q双螺旋横截面的双螺旋横截面的直径直径约为约为2 nm2 nm，相邻两个相邻两个碱基平面之间的距离碱基平面之间的距离（轴距轴距）为）为0.34 nm0.34 nm，每每1010个核苷酸形成一个核苷酸形成一个螺旋，其个螺旋，其螺距螺距（即（即螺旋旋转一圈）的高螺旋旋转一圈）的高度）为度）为3.43.4 nm nm。2.0 nm小小沟沟大大沟沟DNADNA双螺旋结构模型要点（双螺旋结构模型要点（5 5）q两条链借碱基之间两条链借碱基之间的氢键和碱基堆积的氢键和碱基堆积力（即碱基之间的力（即碱基之间的范德华力）牢固的范德华力）牢固的连接起来，维持连接起来，维持DNA双螺旋的三双螺旋的三维结构。维结构。q两条链是碱基互补两条链是碱基互补关系。关系。3.DNA的双螺旋结构稳定因素 氢键氢键 碱基堆积力碱基堆积力 磷酸基上负电荷被胞内磷酸基上负电荷被胞内组蛋白或正离子中和组蛋白或正离子中和 碱基处于疏水环境中碱基处于疏水环境中4.DNA的双螺旋结构的意义 该该模模型型揭揭示示了了DNA作作为为遗遗传传物物质质的的稳稳定定性性特特征征，最最有有价价值值的的是是确确认认了了碱碱基基配配对对原原则则，这这是是DNA复复制制、转转录录和和反反转转录录的的分分子子基基础础，亦亦是是遗遗传传信信息息传传递递和和表表达达的的分分子子基基础础。该该模模型型的的提提出出是是上上个个世世纪纪生生命命科科学学的的重重大大突突破破之之一一，它它奠奠定定了了生生物物化化学学和和分分子子生生物物学学乃乃至至整整个生命科学飞速发展的基石。个生命科学飞速发展的基石。DNA双螺旋构象的类型（三）（三）DNADNA的三级结构的三级结构-超螺旋超螺旋1）超螺旋是指双螺旋进）超螺旋是指双螺旋进一步扭曲或再螺旋的构一步扭曲或再螺旋的构象。象。2）正超螺旋（变紧，过）正超螺旋（变紧，过旋）和负超螺旋（变松，旋）和负超螺旋（变松，欠旋）。欠旋）。3）人类）人类46条染色体的条染色体的DNA总长可达总长可达1.7m，经过，经过螺旋化压缩，实际总长只螺旋化压缩，实际总长只有有200nm。负超螺旋负超螺旋核小体盘绕及染色质示意图DNADNA的存在形式的存在形式-核小体核小体真核生物中真核生物中DNA双螺旋沿着组蛋白双螺旋沿着组蛋白八聚体核心的短轴绕八聚体核心的短轴绕1.75圈，形成圈，形成左手超螺旋，称核小体。左手超螺旋，称核小体。染色质的基本结构单位是核小体。染色质的基本结构单位是核小体。串珠状结构进一步卷曲形成螺线管，串珠状结构进一步卷曲形成螺线管，后者再进一步卷曲形成超螺旋管，后者再进一步卷曲形成超螺旋管，形成染色单体。形成染色单体。基因和基因组基因和基因组1)基因即基因即一段有功能的一段有功能的DNADNA片段，生物细片段，生物细胞中胞中DNADNA分子的最小功能单位（交换单分子的最小功能单位（交换单位）。位）。2)一个细胞或生物体所含的全套基因称一个细胞或生物体所含的全套基因称基因组。基因组。二、二、RNA的分子结构的分子结构1.（一）RNA的分类及特点的分类及特点2.（二）RNA分子的结构特点分子的结构特点 （一）（一）RNARNA的特点及分类的特点及分类结构特点：结构特点：1.碱基组成：碱基组成：A、G、C、U（AU/GC）；）；2.稀有碱基较多，稳定性较差，易水解；稀有碱基较多，稳定性较差，易水解；3.多为多为单链单链结构，少数局部形成螺旋（发夹结构）；结构，少数局部形成螺旋（发夹结构）；4.分子较小。分子较小。分类：分类：1.信使信使RNA（mRNA）2.转运转运RNA（tRNA）3.核糖体核糖体RNA（r RNA）Messenger RNA Messenger RNA1.1.约占总约占总RNARNA的的3%-5%3%-5%，含量最少，种类，含量最少，种类最多。最多。2.2.成熟成熟mRNAmRNA不含内含子，不含内含子，hnRNAhnRNA含有。含有。3.3.mRNAmRNA从从DNADNA转录遗传信息转录遗传信息，并作为并作为蛋蛋白质合成的模板，决定蛋白质的氨基白质合成的模板，决定蛋白质的氨基酸顺序。酸顺序。Ribosome RNARibosome RNA 1)1)约占全部约占全部RNARNA的的80%80%，含量最多。，含量最多。2)2)与与多多种种蛋蛋白白质质结结合合成成核核糖糖体体，后后者是合成蛋白质的场所。者是合成蛋白质的场所。原核生物原核生物真核生物真核生物核糖体核糖体rRNArRNA核糖体核糖体rRNArRNA 30s30s70s70s 50s50s16s16s5s 5s、23s23s 40s 40s 80s80s 50s 50s 18s18s5s5s、5.8s5.8s、28s28sTransfer RNATransfer RNA1)1)约占总约占总RNARNA的的10-15%10-15%，分子最小。，分子最小。2)2)它它在在蛋蛋白白质质生生物物合合成成中中起起翻翻译译mRNAmRNA信信息息，并并将将相相应应的的氨氨基基酸酸转转运运到到核核糖体，参与蛋白质体的合成。糖体，参与蛋白质体的合成。3)3)已已知知每每一一个个氨氨基基酸酸至至少少有有一一个个相相应应的的tRNAtRNA。（二）RNA分子的结构特点分子的结构特点1)tRNA 的结构二级结构二级结构特征特征：单链单链 三叶草叶形三叶草叶形 四臂四环四臂四环三级结构三级结构 特征：特征：在二级结构基础上在二级结构基础上进一步折叠扭曲形成倒进一步折叠扭曲形成倒L型型酵母tRNA Ala 的二级结构DHU环环IGC反密码子反密码子反密码环反密码环氨基酸臂氨基酸臂可变环可变环TC环环CCAAla352）rRNA的分子结构特征特征：单链，螺旋化程度较单链，螺旋化程度较tRNA低低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能5SRNA5SRNA的二级结构的二级结构 3）mRNA的分子结构在转录一章讲授在转录一章讲授第四节第四节 核酸的性质核酸的性质一、一般物理性质一、一般物理性质二、核酸的水解二、核酸的水解三、两性解离三、两性解离四、紫外吸收性质四、紫外吸收性质五、稳定性五、稳定性六、变性六、变性七、复性与杂交七、复性与杂交一、一般物理性质一、一般物理性质1.1.DNA白色纤维状固体白色纤维状固体，RNA白色粉末状白色粉末状固固2.体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇来醇来3.沉淀沉淀DNA；DNA溶液黏度大于溶液黏度大于RNA。4.2.DNA难溶于难溶于0.14mol/L的的NaCl溶液，可溶溶液，可溶于于5.12 mol/L的的NaCl溶液，溶液，RNA则相反，可则相反，可据此据此6.分离二者。分离二者。7.3.加热条件下，加热条件下，8.D核糖浓盐酸苔黑酚核糖浓盐酸苔黑酚 绿色绿色 9.D2脱氧核糖酸二苯胺脱氧核糖酸二苯胺 蓝紫蓝紫色色二、核酸的水解二、核酸的水解1.1.核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。碱性条件下水解切断。2.2.DNADNA和和RNARNA对酸或碱的耐受程度有很对酸或碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，大差别。室温条件下，DNADNA在碱中在碱中变性，但不水解，变性，但不水解，RNARNA水解。水解。3.3.在细胞内核酸分子受在细胞内核酸分子受DNADNA酶作用。酶作用。三、两性解离三、两性解离1.核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离；解离；2.核酸相当于多元酸，核酸相当于多元酸，pH大于大于4时，呈时，呈阴离子状态；阴离子状态；3.等电点等电点四、紫外吸收四、紫外吸收1.1.在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有在核酸分子中嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系，在共轭双键体系，在260 nm260 nm有吸收；有吸收；2.2.可以作为区别蛋白质和对核酸及其组可以作为区别蛋白质和对核酸及其组份定性和定量测定的依据，进行核酸份定性和定量测定的依据，进行核酸纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性纯度鉴定，也可作为核酸变性和复性的指标。的指标。DNA的紫外吸收光谱天然天然DNA变性变性DNA核苷酸总吸收值核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（波长（nmnm）光光吸吸收收123根据根据A260/A280的比值判断核酸样品的的比值判断核酸样品的纯度纯度纯纯DNA：A260/A280=1.8 纯纯RNA：A260/A280=2.0（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）比值明显降低）纯的核酸样品可根据纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其的光吸收值算出其含量含量若若260nm光吸收值光吸收值为为1相当于相当于50g/ml双螺旋双螺旋DNA或相当于或相当于40g/ml单链单链DNA或或RNA或相当于或相当于20g/ml寡核苷酸寡核苷酸。五、五、DNADNA的稳定性的稳定性1.DNA1.DNA的溶液呈粘稠状，但实际上的溶液呈粘稠状，但实际上DNADNA的双螺旋结构僵直而有刚性，易断成的双螺旋结构僵直而有刚性，易断成碎片，这也是目前难以获得完整大分碎片，这也是目前难以获得完整大分子子DNADNA的原因。的原因。2.2.溶液状态的溶液状态的DNADNA易受易受DNADNA酶作用而降酶作用而降解，抽干水分的解，抽干水分的DNADNA性质十分稳定。性质十分稳定。六、六、DNA的变性的变性1.概念概念2.变性条件变性条件3.变性的特征变性的特征1.概念概念是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程的氢键断裂，变成单链结构的过程。2.DNA2.DNA的变性的条件的变性的条件能够引起核酸变性的因素有：能够引起核酸变性的因素有：1）温度升高；）温度升高；2）酸碱度改变、）酸碱度改变、pHpH（11.311.3或或5.05.0）；）；3）有机溶剂如甲醛和尿素、）有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺甲酰胺等；等；4 4）低离子强度。）低离子强度。3.DNA3.DNA变性的特征变性的特征1)变性核酸将失去其部分或全部的生物变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。活性。2)变性改变了变性改变了DNA的二级结构。核酸的的二级结构。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构以它的一级结构(碱基顺序碱基顺序)保持不变。保持不变。3)3)DNADNA的变性过程是突变性的，它在很的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。窄的温度区间内完成。DNADNA解链温度解链温度4)4)紫外吸收值明显增加，即增色效应。紫外吸收值明显增加，即增色效应。5)5)粘度降低，沉降系数增加。粘度降低，沉降系数增加。DNADNA解链温度（熔点，解链温度（熔点，TmTm）1)1)当当50%50%的的DNADNA变性时的温度称为该变性时的温度称为该DNADNA的的解链温度，即增色效应达到一半时的温解链温度，即增色效应达到一半时的温度；一般度；一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之间。之间。2)2)均一均一DNADNA（如病毒）的（如病毒）的T Tm m值范围较小。值范围较小。3)3)分子中分子中G G和和C C的含量越高，越不易变性，的含量越高，越不易变性，T Tm m值越高。值越高。可通过经验公式计算：可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.444)4)T Tm m值随溶液盐浓度增加而增大，值随溶液盐浓度增加而增大，5)5)T Tm m值较低，易变性，不易保存。值较低，易变性，不易保存。溶解曲线溶解曲线与与T Tm m。影响影响Tm值的因素值的因素 DNA的均一性的均一性 DNA中中G-C对的含量对的含量 经验式经验式:(G-C)%=(Tm-69.3)2.44 盐离子强度盐离子强度 增色效应与减色效应增色效应与减色效应 天然天然DNADNA分子在热变性条件下，双螺分子在热变性条件下，双螺旋结构破坏，碱基暴露，在紫外光旋结构破坏，碱基暴露，在紫外光260nm260nm波长处的吸收度明显增加，此现象称为波长处的吸收度明显增加，此现象称为增色效应。增色效应。变性变性DNADNA分子复性形成双螺旋结构时分子复性形成双螺旋结构时其紫外吸收降低的现象称为减色效应。其紫外吸收降低的现象称为减色效应。七、七、DNADNA的复性的复性1)概念概念2)复性的条件复性的条件1.3.影响复性的因素影响复性的因素2.4.复性动力学复性动力学3.5.分子杂交分子杂交1.1.概念概念1.1.1.1.变性变性DNADNA在适当的条件下，两条彼此在适当的条件下，两条彼此分分2.2.开的单链可以重新缔合成为双螺旋结开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，构，3.3.其物理性质和生物活性随之恢复，这其物理性质和生物活性随之恢复，这一过一过4.4.程称为复性；程称为复性；5.5.2.2.对于热变性的对于热变性的DNADNA，在缓慢冷却的条在缓慢冷却的条件件6.6.下可重新结合恢复双螺旋结构，称为下可重新结合恢复双螺旋结构，称为退退7.7.火。火。8.8.3.DNA3.DNA复性后，一系列性质将得到恢复，复性后，一系列性质将得到恢复，9.9.但是生物活性一般只能得到部分的恢但是生物活性一般只能得到部分的恢复。复。DNA的复性图示的复性图示2.DNA2.DNA的复性条件的复性条件1.1.1.1.将热变性将热变性的的DNADNA骤然冷却至低温骤然冷却至低温2.2.时时，DNADNA不可能复性。即淬火。不可能复性。即淬火。3.3.2.2.将将变变性性的的DNADNA缓缓慢慢冷冷却却时时，可可以以复复4.4.性。退火温度性。退火温度T Tm m25255.5.3.3.分分子子量量越越大大复复性性越越难难。浓浓度度越越大，大，6.6.复复性性越越容容易易。此此外外，DNADNA的的复复性性需需要要7.7.一一定定的的盐盐浓浓度度，也也与与它它本本身身的的组组成和成和8.8.结构有关结构有关。高于高于Tm值值5 复性复性 也称退火也称退火 3.影响复性的因素影响复性的因素 样品的性质样品的性质(G+C)DNA的浓度的浓度 DNA片段的大小片段的大小 温度温度 离子强度离子强度 5.5.分子杂交分子杂交1.1.1.1.在变性的在变性的DNADNA溶液中加入外源溶液中加入外源DNADNA单链分单链分子或子或2.2.RNARNA单链分子（与原单链分子（与原DNADNA具有具有同源性同源性），去），去掉变掉变3.3.性条件后复性形成双螺旋结构的过程。性条件后复性形成双螺旋结构的过程。4.4.2.2.这样形成的新分子称为杂交这样形成的新分子称为杂交DNADNA分子。分子。5.5.3.3.利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研或研6.6.究同源性等。究同源性等。分子杂交分子杂交 探针：探针：用于杂交用于杂交的异源的异源DNA或或RNA序列，其序列，其核苷酸序列是核苷酸序列是人工特定的、人工特定的、已知的，经放已知的，经放射性标记的一射性标记的一条链。条链。核酸的变性、复性和杂交变性（加热）变性（加热）探针探针杂交（缓慢冷却）杂交（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）分子杂交的种类分子杂交的种类1)Southern Blot：DNA-DNA杂交杂交2)Northern Blot：DNA-RNA杂交杂交3)Western Blot：抗原：抗原-抗体进行杂抗体进行杂交交4)原位杂交：活体组织上进行杂交，原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光显出荧光Southern印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜第五节第五节 核酸的研究方法核酸的研究方法 一、核酸的分离、提取通则一、核酸的分离、提取通则 为了得到完整的大分子核酸，一般要注意为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点点：1保持低温（保持低温（04）。）。2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。3防止核酸酶的作用。防止核酸酶的作用。抑制DNase：可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。抑制RNase：（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate,DEPC）处理。（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制剂。二、大分子二、大分子DNA的提取的提取 1材料的选择 2细胞破碎 3DNA-蛋白质（DNP）的提取 真核细胞DNA与蛋白质结合成核蛋白（DNP），RNA与蛋白质结合成RNP，而且DNP和RNP常常混在一起。利用DNP和RNP在不同浓度NaCl中溶解度的不同来分离DNP和RNP。可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。相 对 溶 解 度NaCl（mol/L）DNP在NaCl中的溶解度4去蛋白质（1）SDS（2）苯酚法（3）氯仿法（4）酚:氯仿:异戊醇25:24:1 5沉淀DNA 6去杂质（1）去RNA（2）去多糖 7进一步纯化 生物材料 DNP（RNP）DNP 纤维状DNA 较纯DNA 纯DNA*原核生物的DNA是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。破细胞1.0mol/L NaCl*去蛋白质酒精沉淀去RNA柱层析，电泳密度梯度离心去多糖三、RNA的提取 1不同种类RNA的提取 2大分子RNA的提取（1）酚提取（2）酚-氯仿-SDS法 3mRNA的提取 四、核酸纯度鉴定 1.A260/A280 2.电泳 五、核酸含量的测定 1.定磷法 2.定糖法 3.紫外吸收法 本章重点本章重点:1.核酸的化学本质、结构和性质核酸的化学本质、结构和性质2.DNA双螺旋结构的基本特征双螺旋结构的基本特征作业三：名词解释：核酸的变性与复性；分子杂交；名词解释：核酸的变性与复性；分子杂交；DNA DNA 的熔解温度；的熔解温度；增色效应（增色效应（hyper chromic effecthyper chromic effect）；减色效应）；减色效应简答题：简答题：1 1将核酸完全水解后可得到哪些组分将核酸完全水解后可得到哪些组分?DNA?DNA 和和RNA RNA 的水解产物的水解产物有何不同？有何不同？2 P68 2 P68 二、二、1 1、5 5