第五章__转录 (2).ppt

第二节 基因突变 一、突变的概念一、突变的概念v突变：突变：DNA碱基序列发生可遗传的永久性的改变。v染色体畸变和基因突变；v自发突变和诱发突变；v诱变剂、突变生成作用、突变基因、突变体的概念。二、突变的类型二、突变的类型1 1、碱基置换突变、碱基置换突变、碱基置换突变、碱基置换突变;碱基的置换或者一个或多个碱基的增加或者碱基的置换或者一个或多个碱基的增加或者碱基的置换或者一个或多个碱基的增加或者碱基的置换或者一个或多个碱基的增加或者减少引起的突变。减少引起的突变。减少引起的突变。减少引起的突变。v点突变点突变：指指DNA分子上一个碱基的发生改变。分子上一个碱基的发生改变。有转换（不同嘌呤或嘧啶之间）颠换（嘌呤变有转换（不同嘌呤或嘧啶之间）颠换（嘌呤变成嘧啶，或反之）成嘧啶，或反之）v插入：插入：较长的碱基序列的增加较长的碱基序列的增加v缺失：缺失：通常指较长的碱基序列的减少。通常指较长的碱基序列的减少。GdeletionsubstitutioninsertionATGCAATGCATGATGCC2、移码突变v插入、缺失一个或两个碱基都会造成对阅读框架的影响，即产生移码突变。vv移框突变会导致表达产物蛋白质一级结构的改变，导致蛋白质合成的过早终止或蛋白质功能的丧失。3、遗传信息的改变v同义突变：突变没有引起编码氨基酸的改变，又称沉默突变。v错义突变：导致蛋白质多肽链氨基酸序列变化。vv无义突变：肽链合成提前终止。4、突变体对环境的敏感性 v非条件突变：非条件突变：突变基因在任何情况下，都是必需基因，突变引起的基因失活都会导致突变体的出现甚至细胞的死亡。v条件突变：条件突变：在一般条件下，突变体能正常生长或近乎正常，但在特定条件下，突变成为致死突变。5、突变方向v正向突变：野生型突变体v回复突变：突变体野生型v回复突变中，野生型性状可以通过2次突变得到恢复，这第2种突变称为回复突变。vv2次突变通常是第二位点突变，即原突变依然次突变通常是第二位点突变，即原突变依然存在，但第二位点突变抑制了原突变性状。存在，但第二位点突变抑制了原突变性状。影响基因调控序列v启动子：启动子上升突变或下降突变。v操纵子和调节基因：结构基因失去负调控，细胞不根据需要控制蛋白质的合成，即细胞产生不依赖于需要的，有固定数量的蛋白质，基因的这种表达方式称为组成性表达。三、突变原因 v自发突变：自然发生，随机事件v诱发突变：物理因素：物理因素：紫外线、各种辐射；紫外线、各种辐射；化学因素：化学因素：常见的化学诱变剂常见的化学诱变剂vv适应性突变v人工诱变1.DNA复制的错误复制的错误v碱基配对的错误频率约为碱基配对的错误频率约为10-4-10-5；vDNA聚合酶本身具有校对作用聚合酶本身具有校对作用：将不正确：将不正确插入的核苷酸切除掉，重新加上正确的核苷插入的核苷酸切除掉，重新加上正确的核苷酸。这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的酸。这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的机会有机会有10-8-10-10。2.碱基的异构互变碱基的异构互变vDNA中的中的4种碱基各自的异构体间自发地相互变化种碱基各自的异构体间自发地相互变化(例如烯例如烯醇式与酮式碱基间的互变醇式与酮式碱基间的互变)，使碱基配对间的氢键改变。，使碱基配对间的氢键改变。异构体间自发地相互变化形成导致下一世代中异构体间自发地相互变化形成导致下一世代中GC配对取代配对取代AT配对。配对。腺嘌呤的稀有互变异体与胞嘧啶腺嘌呤的稀有互变异体与胞嘧啶胸腺嘧啶的稀有互变异构体与鸟嘌呤胸腺嘧啶的稀有互变异构体与鸟嘌呤3.1 脱嘌呤脱嘌呤（depurination）与脱嘧啶与脱嘧啶v糖苷键断裂糖苷键断裂,嘌呤和嘧啶从嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落链的核糖磷酸骨架上脱落v一个哺乳类细胞一个哺乳类细胞37，20h内内DNA链自发脱落的嘌呤约链自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶个、嘧啶约约500个，个，v长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞(如神经细胞如神经细胞)在整个生活期间自发脱在整个生活期间自发脱嘌呤数约为嘌呤数约为108，约占细胞，约占细胞DNA中总嘌呤数的中总嘌呤数的3%。3.2 碱基的脱氨基碱基的脱氨基(deamination)作用作用 v碱基的碱基的环外氨基有时会自发脱落环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤变成次黄嘌呤变成尿嘧啶、腺嘌呤变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤变、鸟嘌呤变成黄嘌呤成黄嘌呤(X)等。等。v胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。个。4.氧化作用损伤碱基氧化作用损伤碱基v细胞呼吸的副产物细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成等会造成DNA损伤，能产生损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物碱基修饰物，引起，引起DNA单链断裂单链断裂等损伤等损伤v每个哺乳类细胞每天每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为单链断裂发生的频率约为5万次万次。vDNA的甲基化的甲基化、结构的其他变化结构的其他变化等，这些损伤的积累可能等，这些损伤的积累可能导致老化。导致老化。103 m109 nm 1 m106 nm103 nm10-3 nm 10-5 nm1 nmDecreasing wavelengthIncreasing energyRadio wavesMicrowavesInfraredUVX-raysGammaraysCosmicraysVisible spectrum(wavelenght)750 nm 700 nm 650 nm 600 nm 550 nm 500 nm 450 nm 380 nm（二）诱发突变（二）诱发突变1、射线、射线电磁波（电磁波（electromagnetic spectrum）随着波长变短，）随着波长变短，能量增加。能量增加。（1）非电离辐射诱变）非电离辐射诱变主要是主要是15-380nm紫外线紫外线（ultraviolet，UV）：1934年，发现年，发现UV对果蝇卵有诱变作用。到对果蝇卵有诱变作用。到1960年已经搞清楚它的作用机理。年已经搞清楚它的作用机理。成嘧啶二聚体（成嘧啶二聚体（pyrimidine dimers），尤其是），尤其是T-T。导致双螺旋表形，导致复制不能进行，引起细胞导致双螺旋表形，导致复制不能进行，引起细胞死亡。死亡。（2）电离辐射诱变）电离辐射诱变 粒子辐射：粒子辐射：射线、射线、射线射线(32P、35S)、中子、中子(60钴、钴、137铯铯)；电磁波辐射：电磁波辐射：X射线、射线、射线、宇宙射线。射线、宇宙射线。1920年，年，Hermann J.Muller和和Lewis J.Stadler发发现比紫外线波长更短的现比紫外线波长更短的X-rays、gamma rays、以、以及及cosmic rays这些离子辐射有诱变作用。这些离子辐射有诱变作用。X-ray的诱变作用的机理：的诱变作用的机理：产生自由基（产生自由基（free radicals）；）；打断磷酸二酯键，导致染色体断裂。打断磷酸二酯键，导致染色体断裂。X-raysordeletionfragmentationX-rays与与X连锁隐性致死突连锁隐性致死突变变%X-linked recessive lethalsX-ray 剂量剂量(伦琴，伦琴，roentgens)1000 2000 3000 4000 5000 60001020有丝分裂的细胞比有丝分裂的细胞比 G1,S 或或G2 细胞更敏感细胞更敏感2.化学诱变因素化学诱变因素（1）碱基类似物（碱基类似物（base analogs）是一类与标准碱基结构相似的碱基衍生物。可是一类与标准碱基结构相似的碱基衍生物。可掺入复制的掺入复制的DNA。5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-bromouracil，5-BU，BrdU，BUdR）CHNCCCHNOOCH3CHNCCCHNOOBrNCCCHNOHOBrC5-BU（酮式（酮式)Thymine5-BU（烯醇式（烯醇式)与与T结构相似。结构相似。5-BU在烯醇式在烯醇式（enol form）时能与时能与G配对。配对。A-TA-BT-AA-TB-GA-BG-CA=TG C 2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-amino purine，2AP）是是A的类似物。的类似物。亚氨基时可以与亚氨基时可以与C配对。配对。2AP（氨基）（氨基）T2AP（亚胺基）（亚胺基）CA=TG C（2）碱基修饰剂碱基修饰剂定义：直接修饰碱基的化学结构，定义：直接修饰碱基的化学结构，造成碱基的变化，导致诱导突变。造成碱基的变化，导致诱导突变。有亚硝胺、羟胺、烷化剂等有亚硝胺、羟胺、烷化剂等可将烷基团（如甲基、乙基）加到核苷酸上。可将烷基团（如甲基、乙基）加到核苷酸上。甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）能给酮式能给酮式G的第的第6位、位、T的第的第4位上加上甲基。位上加上甲基。G甲基化后与甲基化后与T配对。配对。CH3CH2OSO2CH3ONNNNCCCCCHHNH2ONNNNCCCCCHH NHC2H5ThymineCCCHCNNOOCH3HGuanine6EthylguanineEMSG C A=T烷化剂（3）DNA插入剂插入剂扁平分子，能嵌入嘌呤或嘧啶碱基对之间，引起扁平分子，能嵌入嘌呤或嘧啶碱基对之间，引起DNA双螺旋扭曲，复制时导致缺失或插入，造成移双螺旋扭曲，复制时导致缺失或插入，造成移码突变（码突变（frameshift mutation）。）。吖啶橙（吖啶橙（Acridine orange）(CH3)2NN(CH3)2NH+NC2H5+NH2H2N乙腓啶（乙腓啶（Ethidium）原黄素，二氨基原黄素，二氨基吖啶（吖啶（Proflavin）H2NNH2NH+frameshiftAC GTG CACTGAC GTGNCACNGTGNC原黄素原黄素GCNN适应性突变适应性突变v适应性突变是细胞产生的适应于环境的回复突变。v适应性突变与一般自发突变的区别是：无需细胞生长，必须有非致死的选择条件。vv突变方向和选择条件对应。四、人工诱变体外定向突变 1、定义：、定义：v体外定向突变（离体定向诱变）：体外定向突变（离体定向诱变）：是指利用分子克隆技术在已知DNA序列中特异地产生所需位点的突变。2、体外定向突变的方法、体外定向突变的方法v聚核苷酸介导的单链模板定点突变P141v双引物法定点突变vv用掺入用掺入U U的单链为模板进行聚核苷酸介导的体外定的单链为模板进行聚核苷酸介导的体外定点突变点突变 五、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础v自发突变/自然突变（二二）突变导致基因型改变突变导致基因型改变v没有可察觉的表型改变v个体之间基因型的差别称为多态性多态性（三（三）突变导致死亡突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础第三节 DNA的修复系统 一、复制修复一、复制修复1、尿嘧啶糖基酶系统、尿嘧啶糖基酶系统：v能切除进入DNA的尿嘧啶核苷酸。1、尿嘧啶糖基酶系统、尿嘧啶糖基酶系统的作用过程i）糖基酶识别错配位点，）糖基酶识别错配位点，并制造并制造AP位点。位点。ii）AP内切酶切除相邻核苷酸。内切酶切除相邻核苷酸。iii）DNA 聚合酶修补缺口。聚合酶修补缺口。iv）DNA 连接酶连接缺口。连接酶连接缺口。UACAGTTGGTCAglycosylaseCACAGTTGGTCATGGTCAACAGTTGGTCAACCAGTAP endonucleaseDNA polymeraseDNA ligase第三节 DNA的修复系统 一、复制修复一、复制修复1、尿嘧啶糖基酶系统、尿嘧啶糖基酶系统：v能切除进入DNA的尿嘧啶核苷酸。2、错配修复：、错配修复：错配修复（错配修复（mismatch repair）1.修复系统修复系统识别错配的碱基对，准确地区分出哪一个碱基识别错配的碱基对，准确地区分出哪一个碱基是错误的，切除错误碱基，并进行修复是错误的，切除错误碱基，并进行修复TACGTACGCACGATGCATGCATGCWhich is wrong，A or C？2.E.coli中的中的DNA甲基化酶甲基化酶dam甲基化酶（甲基化酶（Adenine methylase）复制复制甲基化甲基化新合成的链未甲基化修饰新合成的链未甲基化修饰半甲基化半甲基化CTAG复制复制错配错配 识别识别 剪切剪切Polymerase IligaseMethylase3.修复过程修复过程第三节 DNA的修复系统 一、复制修复一、复制修复1、尿嘧啶糖基酶系统、尿嘧啶糖基酶系统：v能切除进入DNA的尿嘧啶核苷酸。2、错配修复：、错配修复：v首先识别母链和有错配的新链；在新链上打开缺口；外切错配片段，填补上正确序列，封闭缺口。3、无嘌啉（、无嘌啉（AP）修复：）修复：vv无嘌啉内切酶（无嘌啉内切酶（APAP内切酶）能切除内切酶）能切除DNADNA中无碱基核中无碱基核糖，留下一段单链糖，留下一段单链DNADNA，然后填补封闭。，然后填补封闭。二、损伤修复 1、光复活：、光复活：是对是对UV诱发的诱发的T-T二聚体。修复二聚体。修复发生在发生在320-370nm的的蓝光蓝光中。中。（1）修复酶：）修复酶：光复活酶（光复活酶（photoreactivation enzyme,PRE）（2）修复机理）修复机理PRE被光子激活，直接切断被光子激活，直接切断T-T之间的交联键。之间的交联键。二、损伤修复 1、光复活：、光复活：v光复活酶（PR酶）：修复嘧啶二聚体。2、甲基转移酶：、甲基转移酶：vO6GG。（以免O6G 与T配对）3、切除修复：核酸内切酶UreABC识别切除损伤DNA片段；DNA聚合酶合成一段新链置换损伤片段，连接酶封闭。1.光修复光修复是对是对UV诱发的诱发的T-T二聚体。修复二聚体。修复发生在发生在320-370nm的的蓝光蓝光中。中。1949年年Albert Kelner发现的。发现的。（1）修复酶：）修复酶：光复活酶（光复活酶（photoreactivation enzyme,PRE）（2）修复机理）修复机理PRE被光子激活，直接切断被光子激活，直接切断T-T之间的交联键。之间的交联键。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶OHP3 3、切除修复切除修复 是细胞内最重要的是细胞内最重要的修复机制修复机制 ，主要由，主要由DNADNA聚合酶聚合酶和和 连接连接酶完成。酶完成。DNA连接酶ATPATP E.coli的切除修复机制i）糖基酶识别错配位点，）糖基酶识别错配位点，并制造并制造AP位点。位点。ii）AP内切酶切除戊糖。内切酶切除戊糖。iii）DNA 聚合酶修补缺口。聚合酶修补缺口。iv）DNA 连接酶连接缺口。连接酶连接缺口。UACAGTTGGTCAglycosylaseCACAGTTGGTCATGGTCAACAGTTGGTCAACCAGTAP endonucleaseDNA polymeraseDNA ligase3.1 碱基切除修复碱基切除修复（1）识别损伤处）识别损伤处修复修复T-T dimer导致的结构变形。导致的结构变形。内切酶内切酶uvrABC识别。识别。(uvr：Ultraviolet repair)3.2 核苷酸切除修复（核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）uvrAB识别嘧啶二聚体或其他大的损伤。识别嘧啶二聚体或其他大的损伤。然后然后uvrA脱离。脱离。T-TAAT-TAAuvrAuvrBT-TAAuvrCuvrB（3）释放单链片断）释放单链片断uvrD是一种解旋酶，把切开的部位解螺旋，是一种解旋酶，把切开的部位解螺旋，释放出单链片断（约释放出单链片断（约12nt）。）。T-TuvrDAA53uvrC与与uvrB结合，并在损伤点两侧（结合，并在损伤点两侧（5端端7nt、3端端3-4nt）切断单链。）切断单链。（2）切割）切割（5）连接）连接DNA ligase连接成完整的链。连接成完整的链。AAligase TT（4）修补）修补DNA polymerase 填补缺口。填补缺口。AAPol 三、复制后修复 1、重组修复、重组修复2、SOS修复修复v只有当DNA损伤后才激活SOS修复系统。vSOS系统使复制叉跳过损伤区域继续合成DNA链。vSOS修复中，损伤的模板不能正确复制，而且DNA多聚酶的校正系统放松了对错误核苷酸的识别，所以产生的DNA分子往往是无功能的。故被称为差错倾向修复。Miroslav Radman首先在切除修复缺陷型菌株中首先在切除修复缺陷型菌株中发现的。发现的。1.重组修复（重组修复（recombination repair）主要是修复主要是修复uvr系统未彻系统未彻底清除的底清除的T-T dimer。当当DNA复制的模板链上有结构变形（如嘧啶复制的模板链上有结构变形（如嘧啶二聚体），此位点就不能充当模板。二聚体），此位点就不能充当模板。DNA复复制酶只能跳过去，留下一个缺口。制酶只能跳过去，留下一个缺口。（1）损伤）损伤（2）修复过程）修复过程 复制酶跳过，复制酶跳过，新链新链中留下缺口。中留下缺口。在在Rec A蛋白的介导下，新链与蛋白的介导下，新链与另一条模板另一条模板链链发生发生重组重组交换，填补缺口。交换，填补缺口。由于单链交换而在另一条模板链上造成的缺由于单链交换而在另一条模板链上造成的缺口可通过口可通过DNA polymerase的修复作用修复。的修复作用修复。在在Rec A蛋白介导下的同源重组。蛋白介导下的同源重组。AATTTTAATTAATTTTAATTTTAASOSSOS修复修复 当当DNADNA损伤广泛难以继续复制时，由此损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。而诱发出一系列复杂的反应。各种与修复有关的基因，组成一个称为各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子调节子（regulon regulon）的网络式调控系统。的网络式调控系统。这种修复特异性低这种修复特异性低 ，对碱基的识别、选，对碱基的识别、选择能力差。即使修复后复制能继续，择能力差。即使修复后复制能继续，DNADNA 保保留的留的错误较多错误较多,会引起较广泛、长期的突变。会引起较广泛、长期的突变。四、限制与修复v细菌为了保护自己细胞的DNA的完整性和准确性，进化出来的一套防止外来DNA入侵的系统。v限制性内切酶切除外来的DNAv甲基化酶识别自身DNA上的限制性内切酶位点，将腺嘌呤甲基化，防止自身的DNA被限制性内切酶水解。