DC-CIK细胞的制备及在肿瘤治疗中的应用.ppt

DC-CIKDC-CIK细胞的制备及在肿瘤细胞的制备及在肿瘤治疗中的应用治疗中的应用 恶性肿瘤的治疗现状恶性肿瘤的治疗现状恶性肿瘤恶性肿瘤治愈治愈4545难于治愈难于治愈5555未缓解未缓解缓解后复发缓解后复发恶性肿瘤的多学科综合治疗恶性肿瘤的多学科综合治疗恶性肿瘤各种治疗手段各具优势与不足恶性肿瘤各种治疗手段各具优势与不足n肿瘤外科学肿瘤外科学n肿瘤放射治疗学肿瘤放射治疗学n肿瘤化学治疗学肿瘤化学治疗学n肿瘤生物学治疗肿瘤生物学治疗n侧重点不同侧重点不同n局部与全身局部与全身n早、中、晚期早、中、晚期肿瘤免疫学治疗的优点肿瘤免疫学治疗的优点n可可以以有有效效地地杀杀灭灭患患者者术术后后和和放放化化疗疗后后体体内内残残存存的的肿肿瘤瘤细细胞胞，达达到到治治疗疗肿肿瘤瘤、预预防防复复发发与与转转移移和和最最终终根根治肿瘤的目的。治肿瘤的目的。n具有具有特异性强、适用性广、副作用轻特异性强、适用性广、副作用轻等优点。等优点。肿瘤免疫学治疗肿瘤免疫学治疗n非非特特异异免免疫疫刺刺激激剂剂及及细细胞胞因因子子治治疗疗：IL2IL2、IL6IL6、IL12IL12、GM-CSFGM-CSF、TNFaTNFa、IFNaIFNa、IFNrIFNr等等体体内内应应用用，装装载有细胞因子基因的细胞治疗。载有细胞因子基因的细胞治疗。n治治疗疗性性疫疫苗苗：肿肿瘤瘤抗抗原原或或多多肽肽抗抗原原疫疫苗苗、装装载载肿肿瘤瘤抗抗原原基基因因的的病病毒毒疫疫苗苗、基基因因修修饰饰的的肿肿瘤瘤细细胞胞疫疫苗苗、APCAPC细胞疫苗、抗独特性疫苗细胞疫苗、抗独特性疫苗。nMabMab导导向向治治疗疗：MabMab、Mab-Mab-毒毒素素、Mab-Mab-同同位位素素、鼠鼠-人单抗、人源单抗、双特异性抗体。人单抗、人源单抗、双特异性抗体。n过过继继性性免免疫疫细细胞胞治治疗疗：供供者者淋淋巴巴细细胞胞输输注注、LAKLAK、TILTIL、CIKCIK、多种方法诱导的多种方法诱导的CTLCTL、DC-CIKDC-CIK等。等。过继免疫疗法过继免疫疗法n通过把在体外扩增的大量特异性效通过把在体外扩增的大量特异性效应细胞回输给患者后，产生直接杀应细胞回输给患者后，产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。伤肿瘤细胞的作用。DC-CIKDC-CIK培养及其应用培养及其应用nCIKCIK细胞：细胞：Cytokine Induced Killer CellCytokine Induced Killer CellnDCDC：Dendritic CellDendritic CellCIKCIK细胞特性细胞特性n分布：肝脏和外周血分布：肝脏和外周血n来源：来源：CD3+CD56+TCD3+CD56+T细胞和细胞和CD4-CD8+TCD4-CD8+T细胞细胞n n一群以一群以CD3+CD56+TCD3+CD56+T为主的异质细胞包括为主的异质细胞包括/T T细胞细胞,/T T细胞细胞n n与与LAKLAK、CD3AKCD3AK细胞相比高效、广谱杀伤、非细胞相比高效、广谱杀伤、非MHCMHC限限制制DCDC与与T T细胞细胞nDCDC高表达高表达MHC-MHC-类、类、类分子，类分子，MHCMHC分子分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHCMHC分子复合物，递呈给分子复合物，递呈给T T细胞，从而启动细胞，从而启动MHC-IMHC-I类限制性类限制性CTLCTL反应和反应和MHC-MHC-类限制性类限制性的的CD4+ThlCD4+Thl反应反应 ；nDCDC还通过其高表达的共刺激分子还通过其高表达的共刺激分子(B7-1(B7-1、B7-2B7-2等等)提供提供T T细胞活化所必须的第二信号，细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答启动了免疫应答。DCDC负载肿瘤抗原负载肿瘤抗原肿瘤杀伤作用肿瘤杀伤作用DCDC在在DC-CIKDC-CIK杀伤肿瘤细胞中的作用杀伤肿瘤细胞中的作用n诱导抗原特异性诱导抗原特异性CTLCTL反应反应n增加增加CIKCIK细胞的扩增倍数细胞的扩增倍数n增强增强CIKCIK肿瘤杀伤效力肿瘤杀伤效力MHC：抗原提呈自分泌细胞因子：INF,IL-12等抑制CD4+CD25+调节T细胞生长CIKCIK细胞的制备细胞的制备PBMNC (CS3000 Plus)In a 3000ml Baxter bagSerum free culture mediumIFN 第一天第一天Il-2 第二天第二天CD3 mAb 第二天第二天IL 1 第二天第二天14 days lCS-3000CS-3000采集采集PBMNCPBMNClFicollFicoll分离分离PBMC,PBMC,洗洗2 2次次l1-21-210106 6/ml/ml接接种种至至含含无无血血清清培培养养基基的的培培养养袋袋中中，1000ml/1000ml/袋袋，加加入入IFN-IFN-1000U/ml1000U/ml，放放置置3737，5%5%的的CO2CO2孵孵箱箱中培养中培养24h24hl加加 入入 IL-1IL-1 100U/L100U/L，CD3CD3单单 抗抗50ng/ml50ng/ml，重重组组人人IL-2 IL-2 300U/L300U/L，继继续续培培养养，每每3 3天天半半量量换换液液，并并补补加加IL-2 IL-2 300U/ml300U/ml。l 分分别别于于第第5 5，7 7，9 9天天取取细细胞胞做做细细胞胞表表型型分分析析（FCMFCM检检测测），细细胞胞杀杀伤伤实实验验（MTTMTT法）法）l收收集集细细胞胞，含含0.5%0.5%白白蛋蛋白白的的生生理理盐盐水水洗涤洗涤l回输回输CD3CD3主要促主要促CIKCIK细胞增殖，促细胞增殖，促IL-2IL-2自分泌，也提高自分泌，也提高CIKCIK杀伤活性杀伤活性IFN-r/IL-1IFN-r/IL-1，上调细胞表面，上调细胞表面IL-2RIL-2R表达，表达，IFN-rIFN-r先于先于IL-2IL-2加入，有效激活效应细胞，增强抗肿瘤加入，有效激活效应细胞，增强抗肿瘤活性活性DCDC的的培养培养BMDCBMDCSerum free culture mediumSerum free culture mediumIL-4,GM-CSFIL-4,GM-CSFTNFTNF 成熟成熟成熟成熟DCDC79 days79 daysIL-4,GM-CSFIL-4,GM-CSFTNFTNFPBDCPBDCTumor antigenDC-CIKDC-CIK共培养共培养 成熟成熟DC CIK细胞细胞+CIKCIK细胞的增殖细胞的增殖62.%84.7%89.5%28.2%43.1%52.3%CIKCIK细胞对自体原代白血病细胞的细胞对自体原代白血病细胞的杀伤作用杀伤作用lCIK细胞对自体原代白血病细胞有明显杀伤作用，且其细胞毒作用随着效靶比的增加而进一步增强，在效靶比为20：1时，其中位杀伤率分别为51.33%,52.95%肿瘤细胞冻融物肿瘤细胞冻融物肿瘤细胞坏死物肿瘤细胞坏死物正常生长的肿瘤细胞正常生长的肿瘤细胞无肿瘤细胞无肿瘤细胞无无DCDC-CIKDC-CIK对肿瘤杀伤作用对肿瘤杀伤作用DC-CIKDC-CIK对肝癌细胞的杀伤活性对肝癌细胞的杀伤活性*DC*DC与与CIKCIK共培养后，共培养后，CIKCIK增殖能力和杀伤活性明显增强增殖能力和杀伤活性明显增强DC/CIK治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究DC-CIKDC-CIK治疗乳腺癌治疗乳腺癌CIK/DC-CIKCIK/DC-CIK治疗恶性血液病合并丙肝治疗恶性血液病合并丙肝HCV-RNAHCV-RNAHCV-RNAHCV-RNA转阴例数转阴例数转阴例数转阴例数 14/18 14/18 14/18 14/18 治疗治疗治疗治疗2 2 2 2疗程以上疗程以上疗程以上疗程以上HCV-RNAHCV-RNAHCV-RNAHCV-RNA持续阴性持续阴性持续阴性持续阴性 6/9 6/9 6/9 6/9ALT/AST/TBILALT/AST/TBILALT/AST/TBILALT/AST/TBIL明显下降或正常例数明显下降或正常例数明显下降或正常例数明显下降或正常例数 10/10 10/10 10/10 10/10CIKCIK治疗治疗1 1例白血病合并丙肝后肝功的变化例白血病合并丙肝后肝功的变化新技术新技术nRetroNectin activated killer cell（RAK）nDC相关的技术RetroNectin activated killer cell（RAK）n重组人纤维蛋白片段(RetfoNectin)可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。该产品已注册美国药典和国际专利。n当包被在培养皿和培养瓶中时，RetroNectin能显著提高逆转录病毒转染入哺乳动物细胞内的效率。nRetroNectin还可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖，可增加体外CIK细胞扩增倍数，及肿瘤杀伤活性。RetroNectin activated killer cell（RAK）zoledronate acid/唑来膦酸 n转染AFP质粒的腺病毒感染DCnDC-CIK共培养n杀伤活性检测健康供着DC和CIK肝癌患者DC和CIKCIK/DC-CIKCIK/DC-CIK治疗后的不良反应治疗后的不良反应n n寒战寒战n n发热发热n n疲乏疲乏n n无力无力n n关节肌肉酸痛关节肌肉酸痛一般一般2424小时内消失小时内消失小小 结结n体外实验证实体外实验证实DC-CIK肿瘤杀伤活性强，并具有肿瘤特异肿瘤杀伤活性强，并具有肿瘤特异性；性；n被认为是新一代免疫治疗的首选方案，已经进入被认为是新一代免疫治疗的首选方案，已经进入I、II期临期临床实验；床实验；n临床实验时间短，病例数尚不多；临床实验时间短，病例数尚不多；n治疗方案和标准尚待进一步规范和统一。治疗方案和标准尚待进一步规范和统一。