RNAi的发现过程ppt课件.ppt
2019-11-25RNA干扰的发现过程指导教师：牛雪梅老师第三小组成员：刘亚君、吕锐利、任苗、史瑞、宋心玥、宋志强、孙文豪野生型试验预期1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组Rich Jorgensen和同事为了让花朵颜色更鲜艳，给矮牵牛花（petunias）注入了一种能形成红色素的基因，但结果却使矮牵牛花完全褪色！也就是说转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因受到抑制。因此他将这种现象命名为“Cosuppression-协同抑制”。1994年，Carlo Cogoni等人把合成合成类胡萝卜素的基因albino一1或albino一3 转入 野生型粗脉胞酶(Neurosporaerassa)发现大约30转染细胞内源性albino一1或albino一3基因的表达水平反而大为减弱，当时称这种现象为“quelling-压制”。1995年，康奈尔大学的Su Guo和Ken Kemphues在试图阻断秀丽隐杆线虫的par-1基因时，本想利用反义RNA技术特异性阻断该基因的表达，同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以观察到基因表达的增强，但得到的结果却是二者都同样被切断了par-1基因的表达途径，这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能对这一意外现象给出合理解释。1998年，法尔等人在考虑已知细胞对dsRNA的反应时，出现了一个特异性问题：有些生物体存在一种对dsRNA依赖的蛋白激酶，它能激活干扰反应机制。因此他们猜想反义协同作用可能反映了一种非特异性的反义作用潜能。他们联合注射与unc-22无关的dsRNA片段，并没有增强单个unc-22-RNA链介导抑制的能力，之后使用另外三个表型特征良好的基因评估dsRNA效应的靶向特异性，unc-54编码全肌收缩所需的肌球蛋白的体壁肌重链亚型；Figure 1 Genes used to study RNA-mediated genetic interference in C.elegans.Intronexon structure for genes used to test RNA-mediated inhibition are shown(grey and filled boxes,exons;open boxes,introns;patterned and striped boxes,59and39untranslatedregions.unc-22.ref.9,unc-54,ref.12,fem-1,ref.14,andhlh-1.fem-1编码两性生殖所需的含锚蛋白重复序列的蛋白质；hlh-1编码正确体形和运动所需的肌球蛋白。分别注射与这些基因相关的dsRNA到线虫体内，在子代中没有出现完全变异的表型。不同相关基因的dsRNA注射到线虫后的显著表型表明，干扰效应在高比例的细胞中发生。为了在细胞水平上检测dsRNA的干扰效应，他们用大肠杆菌PD4251菌株评估一个在肌肉中表达两种不同绿色荧光蛋白（GFP）的转基因系gfp和lacZ活性的干扰，PD4251菌株是一个稳定的转基因菌株，这种菌株在全身肌肉中产生GFP。将gfp和lacZ的dsRNA分别注射到大肠杆菌的幼虫期和成虫期，观察荧光细胞的比例。直接注射gfp的dsRNA可显著降低荧光细胞的比例。他们还发现在低剂量的dsRNA作用下，当动物孵化时，胚胎来源的肌肉细胞经常受到干扰。这些分化细胞的干扰效应在幼虫生长过程中始终存在：随着受影响动物的生长，这些细胞很少或没有产生额外的GFP。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究时发现，在孵育的裂解液中，501bp的Rr-dsRNA和505bp的Pp-dsRNA的放射性大约有15出现在21-23nt的RNA片段中，并且没有检测到其他稳定产物。从右图的条带2、3和9、10可以看出，有无mRNA并不会影响到21-23ntRNA的产生。siRNA的发现 为了进一步了解RNAi的机制，Zamore绘制了三个dsRNA的几个mRNA切割位点的位置，从左图可以发现，分裂的间隔大部分在21-23nt之间，9nt的产生是因为dsRNA的解离能力不够。它们将孵育产生的21-23nt替代dsRNA添加到新的RNAi反应中,也能在体外产生序列特异性干扰。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人2001年，Ketting等人通过测试胚胎提取物Dicer的活性，并利用免疫沉淀、缺失突变体分离、基因转移、Seam细胞分析、RNAi检验等方法解释了Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰和小RNA合成中的作用。Dicer的作用发现烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 Dicer可能参与两个不同的过程，这两个过程都需要将dsRNA加工成小RNA，其中一条途径(ds-RNA诱导)通过RISC复合物和RNAi导致RNA降解。第二种途径(依赖于let-7)通过内源性的、短暂的小RNA及其mRNA靶点之间的相互作用导致翻译的抑制。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 2002年，Brummelkamp等人首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可以有效地、特异性地消除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER（如图1A)，最终的转录体预计会折叠成一个19bp的茎环结构。用pSUPER载体来抑制内源性CDH1基因，检验了pSUPER载体是否产生siRNA，然后检验了pSUPER系统的特异性。图1图2 为了进一步测试载体系统，他们又设计了合成siRNA和pSUPER与CDC20转录体中19nt序列相同的载体。对于CDH1，无论是人工合成的siRNA还是人工合成的RNA都能有效抑制内源性CDC20表达（如图2）。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人pSUPER载体对基因表达的抑制是否足够影响细胞生理机能？他们设计了一个结构来抑制p53（一种电离辐射后稳定的转录因子），结果表明其设计的载体可以抑制内源性p53的表达，使其完全丧失其在DNA损伤反应中的功能（图1D)。图3pSUPER载体是否可以介导基因表达的稳定抑制？MCF-7细 胞 与 含 有 puromycin抗 性 的 载 体pSUPER或pSUPER-p53共转染，结果表明，pSUPER介导的基因敲除持续时间较长，它的转录产物对细胞没有毒性。RNAi作用机制起始：核酸酶Dicer首先识别dsRNA或发卡 RNA（hairpin-RNA）将其切割成 2123 nt 的siRNA。组装：随后siRNA与无活性的RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）结合，在解螺旋酶的作用下siRNA双链解开为单链。效应：由于siRNA与mRNA具有高度同源性，其反义链通过与靶基因mRNA进行特异性结合使 RISC活化，最后RISC中的酶将靶基因mRNA剪断，从而实现基因表达沉默。l2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁 法尔（Andrew Fire）和克雷格 梅洛（Craig Mello），以表彰他们发现了“RNA干扰”机制。l诺贝尔奖评审委员会发布的公报说：法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”。RNA干扰 诺贝尔奖Ken KemphuesKen Kemphues为何没能分享诺贝尔奖的荣誉为何没能分享诺贝尔奖的荣誉？医学奖委员会主席-Karolinska学院教授Bertil Daneholt写的“Advanced Information”中提到，Ken Kemphues（其铺垫性工作是复旦留美学生郭苏做的）未能分享诺贝尔奖荣誉的原因主要在于“remarkably sense RNA（24）could also silence genes,but the results were inconsistent and the effects usually modest”.委员会认为此项发现真正的“第一步”是Mello实验室1997年文章中的“大胆假设”加上Fire和Mello两个小组合作并于1998年完成的“小心求证”如果Kemphues能在其1995年论文的讨论部分大胆猜测一下郭苏的实验对照组用的sense RNA也能导致gene silencing的原因，提出双链RNA也有可能抑制基因表达，那么Kemphues就有可能分享荣誉。Kemphues没能对郭苏意外发现的重要性有足够的认识，因为这不属于他的实验室研究的主攻方向-线虫的胚胎发育。“前人栽树”：1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello首次在秀丽新小杆线虫中证明Su Guo所发现的现象属于转录后水平的基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的。“后人改良”：当他们将T4和T7 RNA聚合酶体外转录制备的单链RNA电泳纯化后再注射于线虫，结果发现只有微弱的基因抑制作用。而将纯化后的dsRNA 一正义链和反义链的混合物注入线虫，发现dsRNA能够高效特 异的阻断相应基因的表达，而且抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级。该小组将这一现象称为“RNA interference-RNA干扰”。首次揭开了Guo和Kemphues的谜底。RNAi：A Phasing-Out Technology?显著的脱靶效应和不可预测的抑制效率其他技术的的出现RNAi,TALEN,和CRISPR三者之间的比较参考文献：Boettcher M,Mcmanus M.Choosing the Right Tool for the Job:RNAi,TALEN,or CRISPRJ.Molecular Cell,2015,58(4):575-585.RNAi的执行更为迅速，节省了的时间和金钱。RNAi不需要在实际的基因敲除实验之前将额外的基因引入细胞，因为大多数细胞都带有完整的RNAi沉默机制。RNAi对TSSs没有特异性。因此，RNAi可以用于转录组但没有基因组测序数据的物种。RNAi针对的是细胞质中的RNA转录本，而不是细胞核中的基因组DNA，不受染色质状态的影响。RNAi相较于相较于CRISPR技术的优势技术的优势选择正确的工具选择正确的工具:RNAi,TALEN,or CRISPR参考文献：Boettcher M,Mcmanus M.Choosing the Right Tool for the Job:RNAi,TALEN,or CRISPRJ.Molecular Cell,2015,58(4):575-585.请老师和同学们批评指正！
