DB22∕T 3172.3-2020 流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测第 3 部分：H3N8亚型马流感病毒(吉林省).pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 3172.32020 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 3 部分：H3N8 亚型马流感病毒 Real-time RT-PCR detection on HA and NA genes of influenza virus Part 3：H3N8 subtype equine influenza virus 2020-10-14 发布 2020-10-30 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 3172.32020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。DB22/T 3172流感病毒HA和NA基因检测 荧光RT-PCR法分为四个部分。第 1 部分：H7N9亚型禽流感病毒；第 2 部分：H7N4亚型禽流感病毒；第 3 部分：H3N8亚型马流感病毒；第 4 部分：H7N7亚型马流感病毒。本部分为DB22/T 3172的第 3 部分。本部分由长春海关提出并归口。本部分起草单位：长春海关技术中心。本部分主要起草人：王伟利、王准、王玮琳、姚贵哲、刘金华、肖芳、李玥、马文晨、杨帆、蔡阳、马玲。DB22/T 3172.32020 1 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 3 部分：H3N8 亚型马流感病毒 1 范围 本标准规定了H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、试验条件、试剂与材料、仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理及试验报告。本标准适用于H3N8亚型马流感病毒检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold）DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethy pyrocarbonate）HA：血凝素（Hemagglutinin）NA：神经氨酸酶（Neuraminidase）RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）RT-PCR：反转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction）Taq 酶：Taq 脱氧核糖核酸聚合酶（Thermusaquaticus DNA polymerase）4 原理 根据H3N8亚型马流感病毒HA基因和NA基因序列设计特异引物和探针，探针结合部位在扩增片段内部。HA基因和NA基因探针分别在5端标记FAM和CY3荧光素作为报告荧光基团，3端分别标记MGB和BHQ1作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥53的外切核酸酶功能，将探针降解，探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。5 试验条件 DB22/T 3172.32020 2 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应按照GB 19489中的有关规定执行。5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 阴性对照：可采用经灭活的不含马流感病毒的鸡胚尿囊液。6.1.2 阳性对照：非感染性体外转录 RNA，-20 保存备用。6.1.3 2RT-PCR Buffer。6.1.4 RT Enzyme Mix。6.1.5 Taq 酶。6.1.6 DEPC 水：0.1%DEPC 处理后的去离子水。6.1.7 引物与探针：见表 1。表1 H3N8 亚型马流感病毒 HA 基因和 NA 基因引物和探针 引物 F1 5 TGGATTTCATTTGCCATATCAT3 引物 R1 5 GCAAATGTTGCATCTAATRTTG3 HA 基因 探针 P1 FAMTGGCAGGCCCACATMGB 引物 F2 5 CTCCAAGAGGGGAAGATGCT3 引物 R2 5 CTGACCTGGAGGTTCGACTA3 NA 基因 探针 P2 CY3CGCCCCACCCACACATCAGTTCCCTGTBHQ1 6.2 材料 6.2.1 离心管（1.5 mL、0.2 mL）。6.2.2 荧光 PCR 反应管（0.1 mL、0.2 mL）。7 仪器设备 7.1 生物安全柜。7.2 高速冷冻离心机（13 000 r/min）。7.3 微量可调移液器(2.5L、10 L、100 L、1 000 L)。7.4 超低温冰箱（-80）。7.5 荧光定量 PCR 仪（至少包含 FAM 和 VIC 通道）。7.6 旋涡振荡器。7.7 高压灭菌器。8 样品 DB22/T 3172.32020 3 8.1 采集 将拭子经前侧鼻道伸入鼻腔深部蘸取呼吸道黏液，取出后立即放入盛有2.0 mL PBS液（含有青霉素和链霉素）的采样管中，编号。8.2 运输与储存 鼻拭子样品在2 8 条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 冰箱中，但应避免反复冻融。9 试验步骤 9.1 核酸提取 采用市售RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪及配套核酸提取试剂进行提取。9.2 荧光 RT-PCR 检测 9.2.1 反应体系 在PCR溶液配制区，反应体系配制见表2与表3，每份检测样品的荧光RT-PCR体系为25 L。用旋涡振荡器进行混匀，瞬间离心后置荧光PCR仪扩增。表2 H3N8 亚型马流感病毒 HA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 用量 L 2RT-PCR Buffer（6.1.3）12.5 RT Enzyme Mix 5 U/L（6.1.4）0.5 Taq 酶 5 U/L（6.1.5）0.5 F1 10 mol/L（6.1.7）1.0 R1 10 mol/L（6.1.7）1.0 P1 15 mol/L（6.1.7）1.0 模板 RNA 5.0 DEPC水（6.1.6）3.5 总计 25 表3 H3N8 亚型马流感病毒 NA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 用量 L 2RT-PCR Buffer（6.1.3）12.5 RT Enzyme Mix 5 U/L（6.1.4）0.5 Taq 酶 5 U/L（6.1.5）0.5 F2 10 mol/L（6.1.7）1.0 R2 10 mol/L（6.1.7）1.0 P2 15 mol/L（6.1.7）1.0 模板 RNA 5.0 DEPC水（6.1.6）3.5 总计 25 DB22/T 3172.32020 4 9.2.2 反应参数 9.2.2.1 第 1 阶段，反转录 45 30 min。9.2.2.2 第 2 阶段，预变性 92 3 min。9.2.2.3 第 3 阶段，92 15 s，53 20 s，60 30 s（在此收集荧光），40 个循环。10 试验数据处理 10.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。10.2 质控标准 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。10.2.2 阳性对照的 Ct 值应30.0，并出现特定的扩增曲线。10.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。10.3 结果判定 10.3.1 阴性 无Ct值且无扩增曲线，或只出现单一通道有荧光信号，均判为阴性。报告样品中不存在 H3N8 亚型马流感病毒核酸。10.3.2 阳性 Ct值均30.0，且HA基因与NA基因同时扩增出特定的扩增曲线，判为阳性，报告样品中存在H3N8亚型马流感病毒核酸。10.3.3 有效原则 Ct值30.0的样本建议重做，重做结果无Ct者为阴性，否则为阳性。11 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容：a)试验对象；b)所使用的标准（包括发布或出版年号）；c)所使用的方法（如果标准中包括多个方法）；d)结果；e)观察到的异常现象；f)试验日期。_