聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang.ppt

1 1、熟悉电泳的基本原理、熟悉电泳的基本原理2 2、掌握、掌握PAGEPAGE的基本原理与操作技术的基本原理与操作技术上午上午:制胶、原理讲解制胶、原理讲解中午：电泳（午餐）中午：电泳（午餐）下午：染色，脱色、观察结果下午：染色，脱色、观察结果电泳：电泳：是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电荷是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电荷的电极方向移动的现象。的电极方向移动的现象。应用应用:蛋白质蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。=Q=Q X/6r/6r Q Q 粒子所带电荷量粒子所带电荷量 X X 电场强度电场强度 r r 粒子半径粒子半径 介质的粘度介质的粘度1 1、内在因素、内在因素:样品自身性质样品自身性质2 2、外在因素、外在因素:电场电场 缓冲液缓冲液 支持介质支持介质a.a.电荷电荷b.b.分子大小分子大小c.c.形状形状v=QX/6r 内因：内因：待分离大分子的性质待分离大分子的性质电流：电流：与电流成正比与电流成正比电压：电压：与电压成正比与电压成正比 常压电泳（常压电泳（100-500V100-500V）高压电泳（高压电泳（500-10000V500-10000V）电阻：电阻：与电阻成反比与电阻成反比 pHpH：解离性质解离性质解离程度解离程度运动方向运动方向电荷量电荷量一般所用离子强度为一般所用离子强度为0.02-0.20.02-0.2之间之间离子强度：离子强度：强度强度过低过低，缓冲能力差，难以维持，缓冲能力差，难以维持pHpH恒定，同恒定，同 时样品扩散严重；时样品扩散严重；强度强度过高过高，减缓样品的迁移率。，减缓样品的迁移率。吸附吸附:支持介质对样品的滞留作用支持介质对样品的滞留作用,可导致样品的拖尾。可导致样品的拖尾。电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动。电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动。当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动 速度；反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳速度；反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳 动速度。动速度。分子筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在分子筛：是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小，则颗粒在 移动的过程中所受到的阻力也就越大。移动的过程中所受到的阻力也就越大。按按支持介质的不同可分为支持介质的不同可分为 纸电泳纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）SDS SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 N N N N，NNNN甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(BisBisBisBis)丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺(AcrAcrAcrAcr)过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵/核黄素核黄素核黄素核黄素 N N N N，N N N N，NNNN，NNNN四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺（TEMEDTEMEDTEMEDTEMED）聚聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(AcrAcrAcrAcr)和交联剂和交联剂和交联剂和交联剂N N N N，N N N N，甲甲甲甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺(BisBisBisBis)在催化剂和加速剂的作用下聚在催化剂和加速剂的作用下聚在催化剂和加速剂的作用下聚在催化剂和加速剂的作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。合而成的三维网状结构的凝胶。合而成的三维网状结构的凝胶。合而成的三维网状结构的凝胶。分类（根据有无浓缩效应）分类（根据有无浓缩效应）连续电泳：连续电泳：电泳体系中缓冲液组成、电泳体系中缓冲液组成、pH值及值及 凝胶孔径大小都相同。凝胶孔径大小都相同。电荷效应、分子筛效应电荷效应、分子筛效应不连续电泳：电泳体系中缓冲液组成、不连续电泳：电泳体系中缓冲液组成、pH值值 及凝胶孔径大小都不相同。及凝胶孔径大小都不相同。电荷效应电荷效应、分子筛效应、浓缩效应、分子筛效应、浓缩效应分离胶分离胶浓缩胶浓缩胶电极缓冲液电极缓冲液凝胶孔径凝胶孔径小小大大缓冲体系离缓冲体系离子组成子组成Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HClTris-GlyTris-GlypHpH值值8.98.96.76.78.38.3浓缩胶浓缩胶,大孔胶大孔胶,Tris-HCl,pH6.7Tris-HCl,pH6.71.1.凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性2.2.缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性 快离子快离子(前导离子前导离子):):氯离子氯离子 ClCl-慢离子慢离子(尾随离子尾随离子):):甘氨酸根甘氨酸根 NHNH2 2CHCH2 2COOCOO-样品中蛋白质的泳动速度介于这两种离子之间样品中蛋白质的泳动速度介于这两种离子之间3.3.电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性_ _+Tris/甘氨酸甘氨酸 pH 8.3Tris/HCl pH 8.9 分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，其受阻滞的程度不同而表现出不同的分离胶时，其受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。的迁移率。进入进入pH8.9pH8.9的分离胶中的分离胶中,各种蛋白质所带净电荷各种蛋白质所带净电荷量不同而有不同的迁移率。表面电荷多量不同而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快则迁移快;反之反之,则慢则慢.分离胶（小孔胶）分离胶（小孔胶）pH8.9pH8.9分离胶分离胶,浓缩胶浓缩胶一一、制胶、制胶(本实验的关键步骤本实验的关键步骤)1 1、安装玻板、安装玻板：将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将将洗净的、带白色边条的玻板水平放好，将U U型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的短型硅胶密封条摆好。然后，将不带边条的短玻板盖在玻板盖在U U型硅胶密封条上。型硅胶密封条上。2 2、安装铁夹：、安装铁夹：用用4 4只铁夹将安装好的玻板夹只铁夹将安装好的玻板夹好。好。注意：注意：1 1）夹子的作用点应和白色边条重合，夹子的作用点应和白色边条重合，避免夹到边条内侧，造成玻板变形。避免夹到边条内侧，造成玻板变形。2 2）玻板下沿的两个夹子尽量下移，玻板下沿的两个夹子尽量下移，使之能够起到使之能够起到“腿腿”的作用，保的作用，保证玻板处于直立状态。证玻板处于直立状态。3 3、配制聚丙烯酰胺凝胶、配制聚丙烯酰胺凝胶:每种试剂用相应的吸量管、滴每种试剂用相应的吸量管、滴管来吸，吸量管上有标记。管来吸，吸量管上有标记。不可混用不可混用，否则污染试剂，影响，否则污染试剂，影响实验结果。实验结果。小烧杯中按下列顺序加入：（小烧杯中按下列顺序加入：（B B液有毒性，尽量不液有毒性，尽量不要接触到皮肤）要接触到皮肤）1A 1A液（液（Tris-HClTris-HCl）1 ml1 ml 2B 2B液（液（Acr-BisAcr-Bis）2 ml2 ml 3 3蒸馏水蒸馏水 1 ml1 ml 4 4过硫酸铵过硫酸铵(现配）现配）5 ml5 ml前面四项加完后，混匀前面四项加完后，混匀 5TEMED 5TEMED 1 1滴滴（是加速剂，是加速剂，加入后很快就会凝固，所以最后加，加完后稍事加入后很快就会凝固，所以最后加，加完后稍事混匀就灌注混匀就灌注）将配制好的分离胶轻轻混匀，注意不要产生气泡将配制好的分离胶轻轻混匀，注意不要产生气泡快速倒入电泳槽两玻璃板之间的缝隙中，快速倒入电泳槽两玻璃板之间的缝隙中，不要产生不要产生气泡气泡。液面高度应距离液面高度应距离短玻璃板短玻璃板上缘约上缘约2-32-3厘米厘米左右，上左右，上面灌制浓缩胶。面灌制浓缩胶。灌制完成，放于水平处不要再动，约灌制完成，放于水平处不要再动，约15-2015-20分钟可分钟可以聚合（聚合时间与室温和加样准确度有关）。以聚合（聚合时间与室温和加样准确度有关）。烧杯中的胶不要扔掉烧杯中的胶不要扔掉（化学聚合）（化学聚合）聚胶过程讲理论聚胶过程讲理论 另一小烧杯中按下列顺序加入：（另一小烧杯中按下列顺序加入：（D D液有毒性，尽液有毒性，尽量不要接触到皮肤）量不要接触到皮肤）1C 1C液（液（Tris-HClTris-HCl）0.4 ml0.4 ml 2D 2D液（液（Acr-BisAcr-Bis）0.8ml0.8ml 3E 3E液液(核黄素）核黄素）0.3 ml0.3 ml 4 4过硫酸铵过硫酸铵 0.6 ml0.6 ml 5 5蒸馏水蒸馏水 0.9 ml0.9 ml 混匀混匀 6TEMED 1-2 6TEMED 1-2滴滴 轻轻混匀，快速倾倒进玻璃板间的缝隙轻轻混匀，快速倾倒进玻璃板间的缝隙,液面液面高度与矮板相平高度与矮板相平。插入样品槽模板插入样品槽模板（又称梳子），不要带进气泡。（又称梳子），不要带进气泡。整个装置在紫外线下照射整个装置在紫外线下照射3030分钟，使浓缩胶充分分钟，使浓缩胶充分聚合（光聚合）。聚合（光聚合）。聚胶过程讲理论聚胶过程讲理论 每四组配制一份，再分装成每四组配制一份，再分装成4 4小份即可。小份即可。1 1血清血清 0.3 ml 0.3 ml （吸血清的吸量管用后要马上清洗，以免堵塞吸血清的吸量管用后要马上清洗，以免堵塞）2C 2C液液 1.0 ml1.0 ml 320%320%或或40%40%的蔗糖的蔗糖 3.0 ml3.0 ml 40.05%40.05%溴芬兰溴芬兰 0.4 ml 0.4 ml （思考（思考2 2：为什么加：为什么加2 2、3 3、4 4这三种液体？这三种液体？）1.1.除去夹子及密封硅胶条除去夹子及密封硅胶条,将玻璃夹板、电泳槽内芯、将玻璃夹板、电泳槽内芯、有机玻璃平板依次放入槽内。有机玻璃平板依次放入槽内。(注意：两玻璃夹板的注意：两玻璃夹板的矮板应与电泳槽内芯接触。矮板应与电泳槽内芯接触。)然后插入楔型板以固定然后插入楔型板以固定玻璃夹板。玻璃夹板。2.2.在外水槽加电泳缓冲液（在外水槽加电泳缓冲液（F F液）至槽体一半的位置，液）至槽体一半的位置，倾斜槽体，使玻璃夹板下沿中的气泡逸出。放正槽倾斜槽体，使玻璃夹板下沿中的气泡逸出。放正槽体，继续加注缓冲液，使体，继续加注缓冲液，使内外槽内外槽F F液的水位液的水位均超过矮均超过矮板，但不能超过高板板，但不能超过高板。3.3.将梳子轻轻取出，让将梳子轻轻取出，让F F液进入梳子形成的加样槽中，液进入梳子形成的加样槽中，准备加样品。准备加样品。加样加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽中加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽中间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面。间位置加样，针尖不要扎破下面的胶面。加样量加样量:10:10 ulul-50 -50 ulul 1)1)加样完毕后，将电泳槽盖好盖，与电泳仪相连接。加样完毕后，将电泳槽盖好盖，与电泳仪相连接。2)2)电电泳泳仪仪电电压压调调至至最最大大，电电流流调调到到最最小小，打打开开电电泳泳仪开关进行恒流电泳。仪开关进行恒流电泳。3)3)浓缩胶浓缩胶:30mA(150V):30mA(150V)分离胶分离胶:40mA(200V):40mA(200V)加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍，以免血清堵加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍，以免血清堵塞针尖。塞针尖。剥胶：剥胶：拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层拆开电泳槽装置，用竹镊子轻轻撬开两层玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶玻璃板，戴上一次性手套，用手和镊子将分离胶剥离到染色液盘内，剥离到染色液盘内，染色染色1515分钟。分钟。脱色脱色：将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色液内，脱色三液内，脱色三次次，每次，每次1010分钟（每次更换新鲜脱分钟（每次更换新鲜脱色液色液80-100ml80-100ml），脱色时在摇床上摇。），脱色时在摇床上摇。点样线 2 1 清蛋白血清蛋白质醋酸纤维素薄膜血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳示意图电泳示意图 +聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白质区带分布示意图质区带分布示意图PAGEPAGE与醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质比较与醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质比较