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动物病毒性疾病分子流行病学动物病毒性疾病分子流行病学研究方法研究方法 江西农业大学动物科技学院江西农业大学动物科技学院何后军何后军 教授教授联系电话：联系电话：0791-3813149E-mail:分子流行病学分子流行病学1972年Kilbourne 博士在美国传染病学会第10次年会上作了题为“流感的分子流行病学”的报告。1977年法国Higginson认为“分子流行病学”是应用复杂精细的技术进行生物材料的流行病学研究。1982年Perera与Weinstein在分子流行病学基础上,提出了“癌症分子流行病学”(molecular cancer epidemiology)一一 产生的背景产生的背景(一一)疾病预防控制中的需求疾病预防控制中的需求传染性疾病传染性疾病 耐药性质粒；病原体变异；新发现传染病。慢性非传染病慢性非传染病 多病因、多阶段、多基因、长潜隐期。人群易感性人群易感性 生物个体间的遗传和环境不同，易感性差异很大；传统流行病学无法有效测量。实验医学实验医学 实验医学的病因假设和防治措施的人群检验。一一 产生的背景产生的背景(二二)分子生物学的快速发展分子生物学的快速发展理论的突破理论的突破 如：DNA双螺旋结构，遗传中心法则，遗传密码子，RNA逆转录，断裂基因，操纵子模型，限制性内切酶，DNA聚合酶，DNA连结酶，染色体外遗传物质等。技术的创新技术的创新 凝胶电泳技术，核酸体外扩增，DNA测序，蛋白质测序，分子杂交，基因克隆，色谱技术，计算机应用。定义定义分子流行病学分子流行病学(molecular epidemiology)(molecular epidemiology)是应用先进的技术测量生物标志生物标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并研究疾病的防治和促进健康的策略和措施的科学。生物标志生物标志（biological marker，biomarker，简称M）指能代表生物结构和功能的可识别物质。分子事件（molecular event）或分子生物标志（molecular biomarker）主要指代表生物结构和功能的生物大分子特征。如DNA、RNA、蛋白质等。现代流行病学遇到的难题现代流行病学遇到的难题（1）传染病方面：病原生物的多样性和多变性，如流感病毒、艾滋病毒；抗生素广泛应用，耐药性病原体不断出现；新发现的传染病，SAS等 传统表型研究 从分子或基因水平阐明（2）研究个体的发病差异 根本阐明个体差异必须从分子水平研究（3）证实疾病的病因(三三)分子流行病学的发展分子流行病学的发展研究内容更加丰富研究内容更加丰富 传染病、慢性非传染病、健康状态。研究手段越来越多研究手段越来越多 主要是分子生物学方法和技术。应用范围不断扩大应用范围不断扩大 流行病学、预防医学、基础医学、生物学、遗传学、环境科学和人类学等。研究的水平不同：研究的水平不同：传统流行病学：宏观水平或表型 分子流行病学：微观水平或基因水平所解决的问题不同：所解决的问题不同：传统流行病学：可阐明暴露与发病之间的联系，但不能揭示疾病发生的机制（黑匣子）。分子流行病学：既可阐明暴露与疾病之间的联系，又可揭示疾病发生的机制。即可以阐明疾病的自然史。二、与传统流行病学的关系二、与传统流行病学的关系 暴露暴露-暴露(E)与剂量(ED)结局结局-健康态(HC)机体临床态(CD)(健康疾病连续带)传统流行病学传统流行病学分子流行病学 暴露生物标志暴露生物标志-外暴露标志(EEM)与剂量(EED)内暴露标志(IEM)与剂量(IED)生物作用标志(BAM)与剂量(BAD)健康疾病连续带健康疾病连续带：健康态亚健康态潜在疾病态临界疾病态亚临床态临床态 效应生物标志效应生物标志：HCM EBEM ASFM PM SCCM CDM 易感生物标志易感生物标志-易感标志与水平(SM&SL)三、与分子生物学的关系 研究对象不同:分子生物学：个体 分子流行病学：群体 研究内容和方向有所不同:分子生物学：基础研究（方法学研究）分子流行病学：应用研究（指导疾病治）分子流行病学的特点分子流行病学的特点与传统流行病学的区别 1.研究水平不同 宏观水平 微观水平 2.所解决问题不同 揭示“黑匣子”之谜与分子生物学的区别 1.研究对象不同 个体 群体 2.研究内容和方向有所不同 侧重基础，侧重应用分子流行病学的主要分子流行病学的主要研究内容研究内容传染病病因及流行规律的探讨非传染病病因及病因致病机制研究疾病易感性的测定疾病防治措施的研究疾病治疗效果和预后评价生物标志（测量指标）的研究暴露测量及其与疾病的关系效应测量及其与疾病的关系易感性测量及其与疾病的关系疾病防治效果评价 传染病病因及流行规律的探讨传染病病因及流行规律的探讨对已知传染病，通过分子流行病学研究可阐明病原体特点，能更准确地分析其传染源和传播途径；对新发现的传染病，可以尽快确定传染病的病因和流行规律。1、研究已知传染病的病原体和流行特点基因水平研究病原体 快速准确阐明 其特点分析病因、传染源和传播途径 利于防治流行或爆发时 病原体的鉴定和分型十分重要传统：从表型进行鉴定、分型 不稳定或无法进行分型现在：从分子或基因水平鉴定、分型 直接反映其遗传本质、特点 稳定可靠2、研究新发传染病病原体和流行特点新发传染病分子流行病学研究方法查找病原体，确定遗传特点阐明病因、传播规律和流行特点如庚肝的发现和心肌V.分离 非传染病病因及病因致病机制研究病因复杂 环境因素+遗传因素通过分子流行病学的研究方法可阐明疾病发生的遗传本质、环境因素致病的分子基础，为疾病的防治提供理论依据。二、疾病易感性的测定个体对疾病都存在一定的感受性，称之易感性以往认为：只有传染病才有确定易感性 特异Ab传染性疾病的易感性与机体某些基因类型有联系，决定免疫反应的方式与强度慢性病也存在易感性，与个体基因型别或序列或其表达产物有关 遗传易感性三、疾病防治措施的研究传染病的预防 通过分子流行病学手段，可以研究疫苗的预防效果、疫苗株引起的感染以及疫苗的逃逸株等问题。非传染病的防治 分子流行病学通过研究病因的致病机制，为三级预防奠定理论基础。以肿瘤为例以肿瘤为例四、疾病治疗效果和预后评价从分子或基因水平评价治疗措施的效果及判断预后，更客观、快速、准确、节约对基因治疗，可能是唯一可行的评价方法。通过检测患者体内是否有导入的基因及导入的基因表达情况，判断治疗效果。生物标志与分子生物学标志生物标志(biological markers，biomarkers)是宿主生物材料(组织、体液、细胞)中可测量的细胞的、生物化学的、免疫的或分子的改变。是可以测量的、能代表生物结构和功能的大分子物质，如DNA、RNA或蛋白质等。分子生物学标志(molecular biomarkers)能反映分子水平、基因水平的DNA损伤、变异和表达的蛋白质分子的生物标志。生物标志的分类在暴露-疾病链中，一般可将生物学标志分为:体内剂量标志、生物有效剂量标志、生物学反应标志、疾病标志，此外，尚有易感性标志：起着重要作用,是决定疾病能否发生的主要因素。常用按疾病发病过程进行分类，根据疾病发生的不同阶段出现不同的标志,分为三类：暴露标志、易感性标志和效应或疾病标志五、生物标志五、生物标志暴露标志暴露标志(exposure marker)与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。效应标志效应标志 指宿主暴露后产生功能性或结构性变化的生物标志，如突变的基因、畸变的染色体等。易感标志易感标志 指宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志。外暴露标志：外暴露标志：是指暴露因素进入机体之前进入机体之前的标志和剂量生物性：微生物、寄生虫、生物毒素等;非生物性：某些化学和物理因素，如吸烟烟雾、环境物质等。内暴露标志：内暴露标志：指暴露因素进入机体之后进入机体之后的标志生物性病原因子生物性病原因子：可以是生物病原因子本身、其代谢产物或与宿主体内生物大分子结合产物，像病毒整合基因、生物毒素-DNA加合物等非生物性病原因子非生物性病原因子：可以是体内转运分子、代谢产物或与宿主靶体结合物等，如暴露于苯并(a)芘后，在淋巴细胞中能检测到特异的DNA加合物。易感性标志(susceptibility marker)易感性标志：易感性标志：指宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志，如宿主的遗传特征、营养、免疫、机体的活动状态等。是在暴露之前就已存在的遗传性或获得性的可测量指标，决定着机体对疾病发生、发展的易感程度。可以探讨疾病发生的个体差异。效应标志(effect marker)或疾病标志(disease marker)宿主暴露于某种因素后产生结构或功能性变化的生物性标志，如突变的基因、畸变的染色体、特异抗体、细胞因子等。在病后的不同阶段，其效应标志不同生物标志的筛选要求：具有较好的特异性和稳定性 检测方法具有较高的灵敏度，特异度高检测方法快速、简便依据：研究目的、生物学标志的本身特性、在疾病过程中的意义、检测方法、生物学标志与所要代表的特定阶段的关联程度。生物标志特性生物标志特性分子特性分子特性 化学结构、组成、物理特性和稳定性等时相特性时相特性 即生物学标志存在的时间长短及其在暴露至疾病不同阶段的表现和意义。变异性变异性 -个体内变异个体内变异 生物标本采集时间、部位等不同造成 -个体间变异个体间变异 不同生物个体的检测结果不相同 -群体间变异群体间变异 不同生物群体的检测结果不相同 -储存变异储存变异 生物标志的生物特性、储存条件、储存时 间等都会影响其检测结果生物标志检测方法生物标志检测方法实用性实用性 研究样本一般较大一定的实验室条件可信性可信性 可信性强 有效性有效性 灵敏度和特异度，注意区分流行病学的灵敏度和实验室测量中所谓的敏感性的不同暴露测量暴露测量外暴露研究外暴露研究 指环境因素暴露，分为生物性因素和非生物性因素。作为分子流行病学测量的生物标志一般是生物性病原因子，如病原生物、生物毒素等。生物性病原因子检测鉴定生物性病原因子检测鉴定 流感嗜血杆菌 病原生物进化变异规律研究病原生物进化变异规律研究 O157大肠杆菌确定传播途径确定传播途径 S.munchen菌感染 非生物性因素的暴露测量非生物性因素的暴露测量 吸烟烟雾 可研究病原生物分型、分类和检定是最有效手段、研究病原生物变异的规律等。这是传染病分子流行病学的重要使命。内暴露研究内暴露研究传染性疾病传染性疾病 应用分子生物学方法直接检测病原体的生物大分子物质如核酸、蛋白质等，使我们能够准确地判断人体是否感染疾病，即感染状感染状况况；用分子生物学技术鉴定各感染者所感染病原体之间的遗传关系，可追踪传染源追踪传染源 慢性非传染性疾病慢性非传染性疾病 内暴露水平 生物作用水平效应测量效应测量传染病传染病 免疫效应：测定体内抗体变化可以判断机体感染状态。病理性效应：测量机体损害性的生物标志可以判断病原生物感染的病理效应。慢性非传染病慢性非传染病 基因表达异常和代谢异常 基因突变或染色体畸变 健康状态：健康状态：一个群体从疾病到健康或从健康到疾病也是一个连续带。通一个群体从疾病到健康或从健康到疾病也是一个连续带。通过健康状态相关生物标志分布的研究，如生长、发育和衰老，可以为过健康状态相关生物标志分布的研究，如生长、发育和衰老，可以为探讨影响健康的因素、制订促进健康的策略和措施提供科学依据。探讨影响健康的因素、制订促进健康的策略和措施提供科学依据。易感性测量易感性测量探明遗传病易感(致病)基因、分布规律、影响因素和防制手段，传染病和寄生虫病的易感性水平高低可以从两个方面评判，一是特异抗体水平，二是对该病原体致病的遗传易感性。第二方面则是分子流行病学研究的重要内容之一。疾病防治效果评价疾病防治效果评价预防评价：分子生物学技术可用于传染病的预防效果评价中，如疫苗接种后的免疫学效果、也可以对不同人群采取措施与否的感染情况进行分析。另外也可用于预防接种发病研究。治疗评价：应用分子流行病学进行治疗措施的效果评价比以临床诊断为依据的效果评价要节约时间、费用和人力，而且更加客观。应用生物学标志的意义能精确测量暴露因素及其水平；揭示生物学反应的早期事件;判定宿主的易感性;提高筛检和诊断疾病的准确性和精确性;评价治疗措施或干预措施的效果;估计疾病的预后;有效控制病因推断过程中的混杂因素;揭示疾病的发病机理。分子流行病学应用的主要研究方法 测量指标 标本采集 现场调查研究方法 实验室检测技术 研究设计 资料分析 测量指标的选择的测量指标的选择的原则原则生物标志应特异、稳定标本采集、储存方便检测方法比较简单、实用，而且操作规范，便于 与同类研究结果比较检测方法灵敏度和特异度高测量指标测量指标暴露指标暴露指标 最好能代表接触剂量或生物作用剂量 易感性指标易感性指标 一般选择抗体水平作为传染病易感性指标，易感基因及其表达产物等作为心脑血管病、恶性肿瘤、糖尿病、遗传病等慢性非传染病的易感性标志。效应指标效应指标 一般以最早期生物效应标志早期生物效应标志作为探索暴露因素的致病作用或干预措施的短期效果评价指标，如抗体产生、代谢异常、基因表达异常等选择结构和功能改变结构和功能改变作为确定暴露的致病作用和早期诊断、早期预防的指标临床诊断标志临床诊断标志作为干预措施长期效果评价或预后的指标标本采集标本采集生物标本生物标本 一般包括病原的和人体的生物标本。常用的有：微生物标本、血液（血清）标本、组织标本、其他生物标本（如唾液、胃液、尿液、精液、头发、媒介生物等）生物标本库生物标本库 通常将储存有一种类型或多种类型生物标本，并能保持它们的生物活性以供研究之用的系统称为生物标本库(biological specimen bank,BSB)，如血清库、组织库、病原生物库等。生物标本采集和储存 分子流行病学研究成功的关键要求要求在采集和储存过程中不能受到“污染”储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识现场调查研究方法现场调查研究方法传统的现场流行病学研究方法,即描述性研究、分析性研究与干预性研究均可应用于分子流行病学。一般需要的样本量相对较小 不宜作大规模现场调查研究 分子流行病学在横断面研究横断面研究中多是小样本抽样调查，在分析性研究分析性研究中多为病例对照研究、队列与病例对照结合的巢式病例对照研究、病例-病例研究等，在实验性研究实验性研究也多采用小样本随机对照试验。实验室技术实验室技术标本的采集与储存：生物标本：病原的、动物的生物标本。生物标本库（biological specimen bank,BSB）：是指储存有一种类型或多种类型生物标本，并能保持它们的生物活性以供研究之用的系统。常用的生物标本：微生物标本、血液标本、组织标本、其他生物标本（如唾液、胃液、尿液、精液、头发、媒介生物）生物标本储存:冷藏（0短期储存,-80长期储存）生物标本采集和储存是研究成功的关键 要求：（1）在采集和储存过程中不能受到“污染”，包括外界生物的、化学的和其他标本的“交叉污染”。（2）储存的生物标本在任何时候进行检测都可以获得一致的结果。（3）所有的生物标本都应有详细的背景材料和鉴别标识。实验室常用检测技术实验室常用检测技术核酸技术核酸技术 核酸电泳图谱 核酸酶切电泳图谱 核酸分子杂交 核酸体外扩增 核酸序列分析 PCR蛋白质技术蛋白质技术 凝胶电泳、蛋白转印杂交、色谱分析、蛋白质测序酶学技术酶学技术 多位点酶电泳法 生物芯片技术生物芯片技术 基因芯片 其他技术其他技术 免疫学技术免疫学技术 如酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫试验(FIA)等；色谱技术色谱技术 如高效液相色谱技术(HPLC)等研究设计研究设计要点：研究假设的建立：力求明确，并有相应的分子生物学技术可予以检验。研究模式的选择：（见调查研究方法）生物标志的选择：既要考虑到标志物的特异性、检测的敏感性、稳定性以及费用等，更要考虑研究的假设或目的。以上构成了分子流行病学研究设计中的三个相互联系的基本要素，而研究假设首当其冲。遗传因素的考虑 应与遗传流行病学研究设计一并考虑。宏观资料的收集：不应忽视偏倚的控制：选择偏倚：选择偏倚：样本选择偏倚、标本采集偏倚（如采集的部位、时间、机体状态、方法等）信息偏倚信息偏倚：检测偏倚、标本储存偏倚（储存条件和时间）。混杂偏倚混杂偏倚：也可出现。辅以动物实验研究问题 动物实验可以较好控制 影响因素，连续采样、动态观察研究样本量的估计问题 原理和方法同一般流行病学研 究设计。资料分析资料分析传统流行病学分析传统流行病学分析 生物标志发生率、检出率、危险度；均数、标准差等 血清流行病学分析血清流行病学分析 抗体的几何平均滴度、阳性率、感染率等 遗传多态性分析遗传多态性分析 等位基因频率、遗传多态度、杂合度等遗传关系分析过遗传关系分析过 遗传一致性(如相似系数S)、遗传差异(如 遗传距离D)遗传关系树等研究设计研究设计研究目的研究目的 充分考虑创新性、实用性、可行性 测量指标测量指标 生物标志是否特异、稳定，标本采集是否方便，是否有灵敏而特异的检测方法测量方法测量方法 简便、成熟，灵敏度和特异度高 调查方法与样本调查方法与样本 样本有代表性，适量结果与分析结果与分析 设计中要预测研究结果，并根据选择的测量指标和测量方法确定资料分析方法 质量控制质量控制 注重现场质量控制的同时，特别重视实验室的质量控制 注意事项注意事项 预实验 基因型基因型(genotype)：具有相同遗传结构的一类生物体。克隆克隆(clone)：广义广义 许多生物特征（表型或基因型）相同的生物体，虽然分离来源、地区、时间可能不同，但它们的这些特征几乎只能解释为共同来源，则这些生物体称为一个克隆。狭义狭义 一个生物体的无性繁殖群体，称为一个克隆。克隆群克隆群(clone cluster)：遗传关系非常紧密的多个生物克隆，可以划分为一个克隆群。实例一实例一研究题目研究题目 人汉坦病毒病（SNV）与病毒宿主关系的确定测量标志测量标志（SNV）/鹿鼠组织、血清、肺；死者取肺组织、存活者采集外周血单核细胞（介质）测量方法测量方法 PCR、Western blotting研究设计研究设计SNV 病毒的序列患者住宅的鹿鼠、附近对照住宅的鹿鼠、远处对照住宅的鹿鼠，所携带SNV 病毒的序列比对；用蛋白印迹法进行SNV 的 IgM和IgG抗体检测患者和死亡者的感染情况；用反转录PCR(RTPCR)扩增SNV RNA 中的特征片段,比较该片段上患者体内病毒与鼠携带病毒的基因序列，应用种系发生分析法判定病毒与宿主的联系。结果分析结果分析从基因水平证明了该病毒是由鹿鼠传染给人的；证明暴露地点为家庭居住地结论：结论：本研究将先进的分子生物学技术和流行病学现场调查有机地结合起来。采用分子流行病学方法,有力地证实了 SNV 病毒是经鹿鼠传播给人的,并明确了暴露地点,有助于深入研究相关因素,以有效地控制汉坦病毒肺综合征的发生与流行。实例二实例二 研究目的研究目的研究布鲁氏菌的生物标志测量指标测量指标布鲁氏菌的核苷酸序列同源性测量方法测量方法 基因外重复回文PCR(REPPCR)、细菌内基因重复一致PCR(ERICPCR)和核酸测序 研究设计研究设计 研究者选择了来自近 20 个国家和地区的 34 株不同种、不同生物型的布氏杆菌，这些细菌分属于牛种、猪种、犬种、沙林鼠种、羊种、绵羊附睾种等 6 种 7 个生物型。进行分子水平的进一步分型研究。结果分析结果分析用 REPPCR技术可把34 种布氏杆菌进一步分为9 个型，后以 ERICPCR又可分出 13 个型，综合这两种方法可以区除牛种的 3 型和 9 型生物型以外的各种不同布氏杆菌。结论结论本案例表明分子生物学技术比表型分析方法更加敏感，即使是属于同种同型的菌株也可进一步区分为不同的基因型，可以对传染源和传播途径进行进一步的追溯。该方法的使用可望为布氏杆菌病的分子流行病学研究提供了简单和实用的生物学标志。应用前景应用前景传染病预防控制 慢性非传染病预防控制 健康状态研究传染病预防控制传染病预防控制 病原体耐药、新病原体的出现、病原体变异、发病谱的变化、传染源的判定、传播途径复杂化、疫苗免疫效果下降等，大多需要应用分子流行病学来解决。病原体研究病原体研究人群感染和传染源研究人群感染和传染源研究 传播途径研究传播途径研究人群易感性研究人群易感性研究疫苗及免疫预防制剂的研究疫苗及免疫预防制剂的研究防治对策和措施研究及其效果评价防治对策和措施研究及其效果评价慢性非传染病预防控制慢性非传染病预防控制暴露测量更加科学、准确；如将暴露测量分为外暴露、内暴露、生物作用剂量等；细微效应可以察觉，可以测定健康疾病连续带不同阶段的效应指标；易感性研究深入到基因和分子水平；防治措施效果评价更加有效。健康状态研究健康状态研究以生物标志为基础的健康状态分布及其影响因素研究正在受到人们的重视；由于健康相关生物标志的精确测量，使健康促进从模糊走向科学；随着分子流行病学对不同生物标志分布及其影响因素研究的深入，人们对健康和疾病的发生、发展过程将有更加深入、细致的了解。展展 望望分子流行病学是一门新兴的边缘学科，尚分子流行病学是一门新兴的边缘学科，尚有很多不成熟的地方，但已显示出了强大有很多不成熟的地方，但已显示出了强大的生命力。随着先进的生物标志检测技术、的生命力。随着先进的生物标志检测技术、计算机技术、信息技术和统计学方法等的计算机技术、信息技术和统计学方法等的不断引入，分子流行病学将把流行病学提不断引入，分子流行病学将把流行病学提高到一个崭新阶段。高到一个崭新阶段。