发酵7第七章 发酵过程控制3.ppt

第三节第三节 微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测 在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。制提供依据。黑箱黑箱 灰箱灰箱检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等检测代谢中间物，分析代谢流向、检测代谢中间物，分析代谢流向、RNA检测检测一一 参数在线检测参数在线检测由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：要求高，因此对传感器有特殊要求：l插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）灭菌（材料、数据）l传感器结构不能存在灭菌不透的死角，传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）以防染菌（密封性好）l传感器对测量参数要敏感，且能转换成传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）电信号。（响应快、灵敏）l传感器性能要稳定，受气泡影响小。传感器性能要稳定，受气泡影响小。带计算机数据采集与控制的生物反应系统带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188原理：化学或物理信号原理：化学或物理信号 电信号电信号 放大放大 记录显示仪记录显示仪 控制器（与设定参数比较）控制器（与设定参数比较）发出调节信号发出调节信号 控制器动作控制器动作介绍几种常用的在线检测的传感器及其工介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理作原理 lpH电极电极l溶氧电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极制作各种离子电极和酶电极（一）（一）pHpH测量测量pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。生物过程控制是一个非常重要的参数。1 1、pHpH的定义的定义影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦时表达方式上的麻烦引进引进pH=-lgH+H+=0.00001时时 用用pH5表示表示2 2、pHpH测量方法测量方法 pH试纸曾经是一种广泛采用的方法试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作优点：方便，易操作缺点：它主观性较强缺点：它主观性较强 质量差异，不同厂家不同批号的质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的试纸测出的pH值会有较大的差别，有时甚至达值会有较大的差别，有时甚至达0.51。对于一些要求较高的场合就适用对于一些要求较高的场合就适用pH试纸试纸pH电极电极（1）pH电极测量原理电极测量原理pH电极实际上是由参比电极电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电与指示电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：池，该电池的表达式可写为：参比电极参比电极 溶液溶液X 指示电极指示电极该电池的参比电极的输出电位该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函是被测体系中氢离子活度的函数。数。E=E0-ln1/=E0-2.303 pH式中式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的电位差计的E值可测出值可测出pH值。值。甘汞电极（甘汞电极（a）232型（型（b）217型型1导线；导线；2加液口；加液口；3-KCl溶液；溶液；4素烧瓷芯；素烧瓷芯；5铂丝；铂丝；6Hg；7Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满汞不会漏失，小管和大管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。u参参比比电电极极 由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐氯氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为池可表示为Hg(L)Hg2Cl2(S)Cl-(L)电极电位产电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-其电极电位为其电极电位为Cl/HgCl,Hg=+ln1/由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响度有关而不受被测溶液的酸碱度影响（2）指示电极）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的电极都可用来测定溶液的pH。l离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。材料的不同而各有特色。测定测定pH值的玻璃电极的值的玻璃电极的敏感膜是厚度为敏感膜是厚度为101103mm的玻璃薄膜，其的玻璃薄膜，其电阻为电阻为50500m。指示电极的关键是敏感膜指示电极的关键是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液溶液待测溶液待测溶液浓度差引起电位差浓度差引起电位差浓差电极浓差电极玻璃敏感膜玻璃敏感膜（3）膜电位）膜电位膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一价阳离子（如且其中的一价阳离子（如Na+离子）与水中离子）与水中H+离子发离子发生离子交换反应。生离子交换反应。SiO-Na+H+SiO-H+Na+使膜表面形成以使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，为主要成分的水合硅胶层，厚度约为厚度约为10-410-5mm液液 试试水水合合硅硅胶胶层层干干 玻玻 璃璃 层层水水合合硅硅胶胶层层内内参参比比溶溶液液1 1 2 2 1-2以以1、2分别表示试液分别表示试液内与内参比溶液中内与内参比溶液中H+离离子活度，子活度，1、2分分别表示外侧与内侧硅胶别表示外侧与内侧硅胶层表面层表面H+离子活度，离子活度，由于水合硅胶层表面与由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外内（内参比溶液）、外（试液）溶液中的（试液）溶液中的H+离离子从活度大的一方向小子从活度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相的外、内侧分别产生相界电位界电位1和和2。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。则有：则有：外侧外侧:1=K1+内侧：内侧：2=K2+可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故故K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质子占据，故基本被质子占据，故1=2，于是玻璃于是玻璃膜内、外侧之间的电位差膜内、外侧之间的电位差膜膜=1-2=由于内参比溶液的由于内参比溶液的H+活度活度2一定，故玻璃一定，故玻璃膜电位与待测溶液的膜电位与待测溶液的H+离子活度（离子活度（pH值）值）成线性关系。成线性关系。膜膜=常数常数+在在25下：下：膜膜=常数常数-0.0591pH（试液）试液）但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使别，即使1=2时，时，膜膜0，这差别所产生，这差别所产生的电位叫不对称电位（的电位叫不对称电位（不对称不对称），这样整个玻），这样整个玻璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。膜电位与不对称电位之和。玻璃玻璃=0 +膜膜+不对称不对称其中，其中，0 与与不对称不对称对于特定的电极是恒对于特定的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液定的，故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈线性关系。值呈线性关系。（4）玻璃电极的性能）玻璃电极的性能l存在不对称电势存在不对称电势不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知不对称电势可以用已知pH值的标准缓冲液来校值的标准缓冲液来校正正 l零电势或等电势点零电势或等电势点 电极电位为零时的溶液电极电位为零时的溶液pH值称为零电势值称为零电势pH值，该值取决于内参比溶液的值，该值取决于内参比溶液的pH值。值。含有含有0.025mol/l的的 KCl和等摩尔浓度的磷和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为酸混合缓冲液的等电势点为pH=7，在，在pH7时，玻璃电极的极性发生改时，玻璃电极的极性发生改变。变。l玻璃电极的测量范围玻璃电极的测量范围 玻璃电极的实际转换系数并不是在整个玻璃电极的实际转换系数并不是在整个pH范范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的际的pH响应曲线如图响应曲线如图测量值测量值pH在碱性范围内在碱性范围内pH10 k降低，测量值偏高降低，测量值偏高在酸性范围内在酸性范围内pH1 k升高，测量值偏低升高，测量值偏低（5）玻璃电极的使用限制）玻璃电极的使用限制l对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。波清洗电极表面。l强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极如氢氟酸溶液会破坏电极l脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层坏水合硅胶层（6）复合电极）复合电极将两支电极都装在将两支电极都装在一根玻璃管中，这一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，种电极叫复合电极，工业上在线检测大工业上在线检测大都使用这种电极。都使用这种电极。它结构紧凑，便于它结构紧凑，便于安装。安装。pH复合电极的结构复合电极的结构屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电极插入被测溶液中后，参比电极当电极插入被测溶液中后，参比电极 隔膜隔膜 被测体系被测体系 玻璃敏感膜玻璃敏感膜 内参内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极原理与双电极pH计的工作原理完全相同，计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。只是结构更紧凑，使用更方便。（二）（二）敏化离子选择性电极敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过化学以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。括有气敏电极和酶电极等。气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极 在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。直到透气膜内外两边该气体的分压相等。进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发生变化，并通过选择性电极应的物质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。的目的。能用气敏电极测定气体有能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸气等，其中以氨电极比较成的蒸气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。熟，应用较广。1、NH4的测量的测量氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。常用氨离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：的氨电极为：1电极管；电极管；2透气膜；透气膜；30.1mol/LNH4Cl溶液；溶液；4pH玻玻璃电极；璃电极；5Ag/AgCl参比电极；参比电极；6，7玻璃膜；玻璃膜；8可卸电极头；可卸电极头；9内参比溶液，内参比溶液，10内参比电内参比电极极在电极管内装有玻璃在电极管内装有玻璃电极电极Ag-AgCl电电极，底部装有一微孔极，底部装有一微孔透气膜，玻璃电极的透气膜，玻璃电极的敏感膜紧贴于透气膜敏感膜紧贴于透气膜上，中间有一极薄的上，中间有一极薄的液层，当氨通过透气液层，当氨通过透气膜渗入内充液薄层，膜渗入内充液薄层，即发生如下反应即发生如下反应NH3+H2O=NH4+OH-内充液中内充液中NH4+远大于生成的远大于生成的NH4+，故故其变化可以忽略不计，而薄层的其变化可以忽略不计，而薄层的pH则则由于由于OH-的生成而升高，因此由玻璃电的生成而升高，因此由玻璃电极检出极检出OH-的浓度，即可检出的浓度，即可检出NH3的浓的浓度，电极电位与氨的浓度是对数响应。度，电极电位与氨的浓度是对数响应。透气膜一般是透气膜一般是0.1mm厚的微孔聚四氟厚的微孔聚四氟乙烯，内充液为乙烯，内充液为0.1mol/L的的NH4Cl溶溶液。氨电极使用的上限为液。氨电极使用的上限为1mol/L,下限下限为为10-6mol/L。2、CO2的测量的测量（1）CO2电极（测溶液中的电极（测溶液中的CO2）结构与氨电极类似。测量结构与氨电极类似。测量CO2时，气体透过时，气体透过电极膜，电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：和水反应，达到以下平衡：CO2+H2O HCO3-+H+产生的氢离子引起产生的氢离子引起pH的变化，就可以测的变化，就可以测出溶解出溶解CO2的浓度。如果的浓度。如果CO2扩散在水或扩散在水或NaHCO3的水溶液中，它们的的水溶液中，它们的pH值会依值会依据下列的式子而变化：据下列的式子而变化：在纯水中在纯水中 pH=常数常数lg 在在NaHCO3溶液中溶液中 pH=常数常数-lgpCO2在在NaHCO3溶液中测量能方便地确定溶液中测量能方便地确定pH和和pCO2之间的对应关系。使用特殊的气之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它能够使体渗透膜，它能够使CO2扩散到扩散到NaHCO3溶液中去，溶液中溶液中去，溶液中pH变化就是变化就是CO2实际分压的测量值实际分压的测量值(2)尾气尾气CO2的测量的测量常用的尾气测定仪是常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定不分光红外线二氧化碳测定仪（简称仪（简称IR），其精度高，可达其精度高，可达 0.5%，量程的，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。养时常被采用。不分光红外线不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的的红外吸收峰在红外吸收峰在2.62.9m和和4.14.5m之间有两之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓的所含浓度。度。（3）尾气氧的仪器分析）尾气氧的仪器分析采用热磁氧分析仪测定采用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。氧的含量。通过通过RQ值的测定，可以分析微生物可能值的测定，可以分析微生物可能利用的基质利用的基质氧化型的或还原型的，分氧化型的或还原型的，分析微生物生长阶段，分析补料的速率是否析微生物生长阶段，分析补料的速率是否合理合理例如，储炬等发现例如，储炬等发现RQ的变化与菌体生长、营养状况的变化与菌体生长、营养状况以及产生抗生素密切相关。如以及产生抗生素密切相关。如20h菌丝开始发生膨大，菌丝开始发生膨大，而此时而此时RQ达到峰值开始下降；达到峰值开始下降；40h左右左右RQ降至谷底降至谷底开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于RQ具有以上的关联特性，他们尝试在具有以上的关联特性，他们尝试在avemectin发发酵过程中利用酵过程中利用RQ作为补料控制的参考之一。作为补料控制的参考之一。3 3、排气氧、排气、排气氧、排气COCO2 2和呼吸熵和呼吸熵酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。例如脲酶电极，把脲酶固定在例如脲酶电极，把脲酶固定在NH3气敏电极或气敏电极或CO2气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生如下的分解反应：如下的分解反应：CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2通过通过NH3或或CO2气敏电极测定气敏电极测定NH3或或CO2的分压即可达到间接测定尿素的目的。的分压即可达到间接测定尿素的目的。4 4、酶电极、酶电极（三）（三）溶氧的测定溶氧的测定 对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。极谱型极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，受需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小气流影响小 原电池型原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受气流和气泡影响大。大，受气流和气泡影响大。现在国内外测定溶液中的溶解氧基本现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用上用极谱型的复膜氧电极极谱型的复膜氧电极。复膜氧电极可分为复膜氧电极可分为 敞口式敞口式 封闭式封闭式敞口式敞口式 在电极的玻璃管上有一个小在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极有利于保护电极封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌时玻璃管受压大汽灭菌时玻璃管受压大现在使用的大多数是敞口式电极现在使用的大多数是敞口式电极1 1、复膜氧电极的工作原理、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成铅、锡、铝等组成。当给电极施加极谱电。当给电极施加极谱电压（压（0.60.8V负电压）时，溶液中的氧就负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。和电流成正比关系。在阴极表面发生的电极反应：在阴极表面发生的电极反应：1/2O2+H2O+e-2OH-阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴极，于是在二电极之间形成电流，流向阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。电流越大。阳极上的反应是：阳极上的反应是：Pb+2ACO-Pb(ACO)2+2e-化学信号转变成电信号化学信号转变成电信号2 2、电极的构造、电极的构造在阴极银（铂）在阴极银（铂）片的前面包一张片的前面包一张半透膜，氧可以半透膜，氧可以透过半透膜达到透过半透膜达到阴极上进行电极阴极上进行电极反应。该半透膜反应。该半透膜固定在阴极表面。固定在阴极表面。小孔用于压力补小孔用于压力补偿。偿。3 3、溶氧电极的影响因素、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵敏度）电极的灵敏度电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：IS=NFA(pm/dm)pO2式中式中IS电极电流电极电流 N电子数电子数 F法拉第常数法拉第常数 A阴极表面积阴极表面积 Pm氧在复膜中的穿透系数氧在复膜中的穿透系数 PO2被测溶液中的氧分压被测溶液中的氧分压 dm膜的厚度膜的厚度增加灵敏度因素：增加灵敏度因素：l增加膜穿透系数增加膜穿透系数pml减小膜厚度减小膜厚度dml增加阴极表面积增加阴极表面积A扩散速度扩散速度 因为电极表面的氧浓度因为电极表面的氧浓度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度搅拌速度、通气量和培养液粘度搅拌速度、通气量和培养液粘度（2）温度的影响）温度的影响电极还会受温度的影响电极还会受温度的影响l氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降l温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增加，增加了电化学反应速率。扩散增加，增加了电化学反应速率。由于后者影响比较显著，因此随着温度的由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，电极输出电流呈指数上升。所以电上升，电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。溶解度变化的情况。4 4、电极的标定、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定）零点标定用饱和用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。稳定后，调节零点旋钮显示零值。（2）饱和校正（满刻度）饱和校正（满刻度）进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。即为饱和值。5.5.摄氧率摄氧率r r的测定的测定(1)用溶氧电极测定用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。测定前先用纯水标定电极，得到变化。测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：单位电流代表的溶氧浓度：I饱饱在饱和氧浓度在饱和氧浓度C*时的电流值时的电流值I残残氧浓度为零时电极所具有的电流氧浓度为零时电极所具有的电流若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也下降，仪表上电流值也不断下降。不断下降。R=(-i/t)t停止供气后停止供气后CL下降到最低点下降到最低点时所需时间时所需时间 i在在t时间内的电流变化时间内的电流变化(2)用热磁氧分析仪测定用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少，根化率几乎完全取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，可以算出摄氧率据排气中的氧含量，可以算出摄氧率设进口氧含量为设进口氧含量为21%r=每小时通气量每小时通气量（0.21-出口氧出口氧%）*22.41000*V6 6、氧传递系数、氧传递系数kLakLa的测定的测定设备的设备的KLa可以用亚硫酸钠法来测定，可以用亚硫酸钠法来测定，但它是在非发酵过程中测定的，不能完但它是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发酵过程中的全代表发酵过程中的KLa值。其它测定值。其它测定方法有方法有(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示此时供氧和需氧达到平衡，即值表示此时供氧和需氧达到平衡，即 r=KLa(C*-CL)式中式中C*可以查得，可以查得，CL可以用溶氧电极测可以用溶氧电极测得，得，r也可算出，因此可求得也可算出，因此可求得KLa值值例：一装料为例：一装料为7L的发酵罐，通气量的发酵罐，通气量1l/L.m，操作压力为操作压力为0.3Kg/cm2，在某发在某发酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓度的度的25%，空气进入时的氧含量为，空气进入时的氧含量为21%，废气排出时的氧含量为，废气排出时的氧含量为19.8%（1atm时氧饱和浓度时氧饱和浓度C*=0.2mmol/L）求此时菌求此时菌的摄氧率的摄氧率r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7KLar/0.26(0.21.0.198)(2)单用溶氧仪测定单用溶氧仪测定用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线曲线CL/t=KLa(C*-CL)-rCL=-1/KLa(CL/t+r)+C*将将CL对对CL/t+r作图，得到一条直线，斜率作图，得到一条直线，斜率为为-1/KLa因此可求得因此可求得KLa,延长直线与纵坐标相延长直线与纵坐标相交点为交点为C*溶解氧浓度随通气变化的情况溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取的求取二二 参数的离线检测进展参数的离线检测进展（一）（一）利用高效液相（利用高效液相（HPLC）分析代谢分析代谢中间产物中间产物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程况。从而有的放矢的控制发酵过程例：鸟苷生产例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发在鸟苷发酵中，发现发酵到现发酵到40小时后小时后鸟苷合成速率下降，鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖降，而且由于耗糖,使发酵过程使发酵过程pH下降，下降，补入氨水增多。那补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了么糖耗到哪里去了呢？呢？于是进行以下一些于是进行以下一些测定与分析测定与分析什么因素导致什么因素导致pH下降？下降？1 1、有机酸的积累、有机酸的积累 有机酸积累有机酸积累 pH下降下降 补加补加氨水氨水 在正常代谢情况下，细胞通过在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的若发酵后期有机酸积累会引起加入的NH4+积累，相应出现产苷速率下降。积累，相应出现产苷速率下降。代谢不代谢不正常正常测定以下中间物测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发酵后期丙酮酸积累2 2、氨基酸的积累、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和机酸和NH4+积累。积累。氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在体合成，在8小时之前已经降到很低水平，小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在并始终维持在低水平，而在48小时左右丙小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。3 3、分析原因、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。丙酮酸积累丙酮酸积累 氨水补加增加氨水补加增加NH4+积累积累抑制抑制GS抑制抑制TCA循环循环丙酮酸积累丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶EMP流量增加流量增加恶性循环恶性循环丙氨酸丙氨酸积累积累（二）（二）代谢流迁移的酶学证明代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖代谢途径关键酶糖酵解途径（糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析磷酸果糖激酶的时序分析12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以所以PFK的活力相对较低。的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代途径的糖代谢通量已有了明显的增加。谢通量已有了明显的增加。丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在而是在24小时就基本上达到其最大值，随小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素素 磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP）关键酶）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化萄糖脱氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢磷酸葡萄糖脱氢生成生成6磷酸葡萄糖酸内酯磷酸葡萄糖酸内酯。6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持从而保持EMP和和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到的形成产物；但是到40小时后，小时后，6磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在谢在HMP途径通量下降而途径通量下降而EMP途径通量增加。途径通量增加。三羧酸三羧酸(TCA)循环的关键酶循环的关键酶三羧酸循环是三羧酸循环是“消耗消耗”丙酮酸的途径，丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。循环中的第一个限速步骤。柠檬酸合成酶时序分析柠檬酸合成酶时序分析从图可以看到，从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量循环的通量并没有发生明显的增加。即并没有发生明显的增加。即代谢流迁移代谢流迁移发生在发生在EMP和和HMP之间，主要是由于之间，主要是由于EMP和和HMP途径之间的分配平衡被打破途径之间的分配平衡被打破所造成的。所造成的。EMP途径代谢流的增加造成途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。了一种代谢流的溢流现象。丙氨酸脱氢酶的时序分析丙氨酸脱氢酶的时序分析在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。