重组蛋白药物纯化与质量控制课件.ppt

重组蛋白药物纯化与质量控制ContentsLOGO蛋白纯化原则与方法1蛋白质量控制方法2蛋白纯化原则LOGO生化分离技术基因重组技术免疫检测技术给人类带来了抗体和药物。现代生物技术蛋白纯化原则LOGO确定目标purity,quantity,biologicalactivity,economy充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation确定活性测定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants尽量减少纯化步骤extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogicallyLOGO蛋白纯化原则GuidelinesforProteinPurification纯化流程LOGO原材料的获取原材料的获取动物植物培养物纯化流程LOGO纯化流程LOGO细胞破碎蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素粗提沉淀相分离分子筛精提各种色谱电泳分离差速离心研磨超声渗透压酶保存预处理原材料的获取浓缩保存状态保存条件保存期限纯化流程LOGOCaptureCaptureLOGOResolutionSpeedRecoveryCapacityInitialpurificationofthetargetmoleculefromcrudeorclarifiedsourcematerialConcentrationandstabilization(e.g.removalofproteases)IntermediatePurificationIntermediatePurificationLOGOResolutionSpeedRecoveryCapacityRemovalofbulkimpuritiesPolishingPolishingLOGOResolutionSpeedRecoveryCapacityFinalremovaloftracecontaminants,e.g.structuralvariantsofthetargetprotein纯化流程LOGO一般生产纯化不超过4个步骤。分离纯化机制LOGO带电基团不同的大小和尺寸疏水基团相互作用极性不同LOGO分离纯化机制不同层析介质的成本：离子交换，金属螯合，疏水层析，分子筛，亲和层析LOGO稳定性（PH值，活性）等电点疏水性分子大小，形状。关键辅助因子关键杂质产品浓度引进污染物产品纯度单位成本产量检测方法-质量控制纯化方法纯化总结LOGO纯化总结DevelopassaymethodsSettheaimsCharacterizethetargetproteinUsedifferentseparationprinciplesUsefewstepsLimitsamplehandlingbetweenpurificationstepsRemoveproteasesquicklyReducevolumeinearlystepTRY!LOGO纯化总结LOGO19Contents效价（活性）鉴定安全性杂质稳定性一致性蛋白质含量细胞生物学微生物学免疫学生物化学纯度分子生物学重组蛋白药物的质量控制LOGO常规质量控制方法20SDS-PAGEWesternBlotELISAHPLCLOGO聚丙烯酰胺凝胶(PAG)21单体：丙烯酰胺(Acr)交联剂：甲叉双丙烯酰胺(Bis)聚合剂：过硫酸铵（APS）催化剂：四甲基乙二胺(TEMED）产物：三维网状结构的凝胶.电泳(E)带电颗粒（蛋白质）在电场作用下，在PAG上向着与其电荷相反的电极移动，从而达到分离的效果。SDS-PAGELOGO蛋白质在PAGE中的分离因素22电荷因素分子大小分子形状SDS-PAGE23灵敏度1mg(1)纯度分析(2)分子量的测定(3)初步鉴定(4)含量的测定(配合扫描半定量)(5)水解的分析(如酶谱法)(6)WesternBlotting的前部分(7)氨基酸序列分析-结合质谱SDS-PAGELOGOSDS-PAGELOGO电泳出现两条或者两条以上条带免疫印迹SDS-PAGELOGO将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品。印迹法(Blotting)通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。Western印迹法WersternBlotLOGO膜的特点27LOGO28p半干转v用滤纸吸Buffer来做转移体系v适合转移小分子量的蛋白；v半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；v56mA/膜1hp湿转v将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里v适合转移大分子量（100KD以上）蛋白；v湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定；v300mA1hWersternBlot转移方法LOGOWersternBlot直接法v优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带v缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便LOGO间接法WersternBlotv优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.可选择不同的Markerv缺点：1.交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化LOGO显色显色方法代表类型特点酶促底物发光法酶促底物发光法 DAB显色法显色法稳定性好，灵敏度较高稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，），背景一般，成像性较差，药品疑有成像性较差，药品疑有一定致癌性。一定致癌性。化学发光法化学发光法（推荐使用）（推荐使用）ECL发光法发光法稳定性好，灵敏度高稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以），背景可以很低，成像性好，且可很低，成像性好，且可以重复标记。以重复标记。放射自显影底物化学发光ECL底物荧光ECF底物DAB呈色ECL:（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。WersternBlot灵敏度1-5ngq目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白的组织定位q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的表达量分析32WersternBlotLOGO3333Step4转膜Step6免疫反应Step7显色检测Step2蛋白定量Step3SDS-PAGEStep1蛋白提取Step5封闭WersternBlotLOGOELISAELISA(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。优点：快速、灵敏、定性、定量、定位，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。LOGOELISA（1 1）直接法测定抗原直接法测定抗原A.A.将将待测抗原待测抗原吸附在载体表面；吸附在载体表面；B.B.加酶标抗体，形成抗原加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；抗体复合物；C.C.加底物。加底物。LOGO（2 2）间接法测定）间接法测定抗体抗体A.A.将抗原吸附于固相载体表面；将抗原吸附于固相载体表面；B.B.加加待测抗体待测抗体,形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物;C.C.加酶标抗体；形成抗原加酶标抗体；形成抗原-抗体抗体-抗抗体复合物；抗抗体复合物；D.D.加底物。加底物。ELISALOGO（3 3）双抗体双抗体夹心法测定夹心法测定抗原抗原A.A.将抗体吸附于固相表面将抗体吸附于固相表面;B.B.加加待测抗原待测抗原，形成抗原，形成抗原-抗体复合物抗体复合物;C.C.加酶标抗体，形成抗体加酶标抗体，形成抗体-抗原抗原-抗体的夹心复合物；抗体的夹心复合物；D.D.加底物。加底物。用抗体包被固相载体加入抗原Sample(二价以上)，温育加入酶标抗体，温育加入底物，显色ELISALOGOELISA（4 4）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原A.A.将抗体吸附在固相载体表面将抗体吸附在固相载体表面;B.B.同时加入酶标抗原和同时加入酶标抗原和待测抗原待测抗原，竞争结合抗体；，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原；C.C.加底物。对照孔与样品孔差未知抗原量。加底物。对照孔与样品孔差未知抗原量。待测抗原酶标抗原39灵敏（纳克水平）、特异、简单、快速、易于自动化操作。一天之内可以检查几百甚至上千份标本，高通量检测筛选。应用：1、定量检测抗原或抗体成份。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。ELISA40输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统工作原理HPLC是以液体为流动相，并用高压输送，色谱柱采用填充颗粒十分细小的高效分离柱，柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测.HPLC41类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机物分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析HPLCHPLC的图形结果42l色谱图(Chromatogram):l色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间色谱峰时间(分)基线峰高峰宽响应值HPLC43从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析根据色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据根据色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据(R值）HPLC在生化中,主要用在下面几处:1纯度；2分子量；3肽谱;4分离制备蛋白质和肽；5脱盐。44Application灵敏度0.1ng/mLHPLCLOGO常规质量控制方法45SDS-PAGEWesternBlotELISAHPLCLOGOSOP:StandardOperationProcedure标准作业程序LOGOLOGOWhatisQCQA?LOGOLOGOLOGO