HPLC高效液相色谱解读课件.ppt

Tanghui.pha.shzu1 1高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography，HPLCHPLCHPLCHPLCTanghui.pha.shzu2 2 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）是是20世纪世纪60年代年代末末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：进行比较：第一节第一节 概概 述述Tanghui.pha.shzu3 3 1 1 1 1高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法 HPLC优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3min-1.如分离苯的羟基化合物，如分离苯的羟基化合物，7个组分只需个组分只需1min就可完成。就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径柱径0.9cm，流动相速度为流动相速度为30cm3h-1，需用需用20多小时才能分多小时才能分离出离出20种氨基酸；而用种氨基酸；而用HPLC，只需只需lh之内即可完成。之内即可完成。又如用又如用25cm0.46cm的的LichrosorbODS(5)的柱，采的柱，采用梯度洗脱，可在不到用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中内分离出尿中104个组分个组分.第一节第一节 概概 述述Tanghui.pha.shzu4 42 2 2 2HPLCHPLC与与与与GCGC(1)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近。对于占有机物总数近80的那的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用采用HPLC进行分离和分析。进行分离和分析。(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相可中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。方便。第一节第一节 概概 述述Tanghui.pha.shzu5 5(3)GC一一般般都都在在较较高高温温度度下下进进行行的的，而而HPLC法法则则经经常常可可在室温条件下工作。在室温条件下工作。总总之之，HPLC是是吸吸取取了了GC与与经经典典液液相相色色谱谱优优点点，并并用用现现代代化化手手段段加加以以改改进进，因因此此得得到到迅迅猛猛的的发发展展。目目前前HPLC已已被被广广泛泛应应用用于于分分析析对对生生物物学学和和医医药药上上有有重重大大意意义义的的大大分分子子物物质质，例例如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、氨氨基基酸酸、多多糖糖类类、植植物物色色素素、高高聚聚物物、染染料料及及药药物物等等物物质质的的分分离和分析。离和分析。HPLC主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。第一节第一节 概概 述述Tanghui.pha.shzu6 63.3.液相色谱分离原理及分类液相色谱分离原理及分类液相色谱分离原理及分类液相色谱分离原理及分类 和和GC一样，一样，LC分离系统也由固定相和流动相组成。分离系统也由固定相和流动相组成。其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。的大小，决定色谱过程的保留行为。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。阻色谱等类型。第一节第一节 概概 述述Tanghui.pha.shzu7 7第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu8 8第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器一、流程（一、流程（process of HPLC）首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。此得到液相色谱图。Tanghui.pha.shzu9 9第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu1010二、主要部件（二、主要部件（main assembly of HPLC）第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器4 4（6 6）个主要部分：）个主要部分：）个主要部分：）个主要部分：高压输液系统；高压输液系统；高压输液系统；高压输液系统；脱气装置；脱气装置；脱气装置；脱气装置；梯度洗脱；梯度洗脱；梯度洗脱；梯度洗脱；进样系统；进样系统；进样系统；进样系统；分离系统；分离系统；分离系统；分离系统；检测系统；检测系统；检测系统；检测系统；此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。Tanghui.pha.shzu1111第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu1212 1 1高压输液系统高压输液系统高压输液系统高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐储液罐储液罐储液罐、高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵、过滤器过滤器过滤器过滤器、压力脉动阻力器压力脉动阻力器压力脉动阻力器压力脉动阻力器等组成。等组成。高压输液泵高压输液泵高压输液泵高压输液泵 核心部件核心部件。压力：压力：150350105 Pa。应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu1313第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器 常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵恒流泵和和恒压泵恒压泵两种。两种。恒流泵特点：恒流泵特点：在一定操作条件下，输出流量保持恒定在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵特点：恒压泵特点：能保持输出压力恒定，但其流量则随色能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。应用最多的是机械往复泵。Tanghui.pha.shzu1414第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有中又有螺旋传动注射泵螺旋传动注射泵、单活塞往复泵单活塞往复泵、双活塞往复泵双活塞往复泵和和往复式隔膜泵往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能见下表。几种输液泵的基本性能见下表。名名名名 称称称称 恒流或恒压恒流或恒压恒流或恒压恒流或恒压 脉冲脉冲脉冲脉冲 更换流动相更换流动相更换流动相更换流动相 梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱 再循环再循环再循环再循环 价格价格价格价格 气动放大泵气动放大泵气动放大泵气动放大泵 恒压恒压恒压恒压 无无无无 不方便不方便不方便不方便 需两台泵需两台泵需两台泵需两台泵 不可不可不可不可 高高高高 螺旋传动注射泵螺旋传动注射泵螺旋传动注射泵螺旋传动注射泵 恒流恒流恒流恒流 无无无无 不方便不方便不方便不方便 需两台泵需两台泵需两台泵需两台泵 不可不可不可不可 中等中等中等中等 单活塞往复泵单活塞往复泵单活塞往复泵单活塞往复泵 恒流恒流恒流恒流 有有有有 方便方便方便方便 可可可可 可可可可 较低较低较低较低 双活塞往复泵双活塞往复泵双活塞往复泵双活塞往复泵 恒流恒流恒流恒流 小小小小 方便方便方便方便 可可可可 可可可可 高高高高 隔膜往复泵隔膜往复泵隔膜往复泵隔膜往复泵 恒流恒流恒流恒流 有有有有 方便方便方便方便 可可可可 可可可可 中等中等中等中等 Tanghui.pha.shzu1515第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器（动画）（动画）Tanghui.pha.shzu1616第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器双活塞往复泵：双活塞往复泵：如下如下图图a所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得的排液特性如的排液特性如图图b所示，即具有稳定的输出流量，这所示，即具有稳定的输出流量，这样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。Tanghui.pha.shzu1717第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器 双活塞往复泵的输液双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。流量比单活塞泵小得多。优点：优点：不必使用消除脉冲的不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗。的压力消耗。缺点：缺点：设备成本较高，流量设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。调节也比单活塞泵复杂。双活塞往复泵的构造和排液特性双活塞往复泵的构造和排液特性Tanghui.pha.shzu1818（动画）（动画）第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器 优点：优点：优点：优点：隔膜泵活塞不直隔膜泵活塞不直隔膜泵活塞不直隔膜泵活塞不直接与流动相接触，故不存在接与流动相接触，故不存在接与流动相接触，故不存在接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的活塞密封垫磨损对流动相的活塞密封垫磨损对流动相的活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵死体积小（约污染。隔膜泵死体积小（约污染。隔膜泵死体积小（约污染。隔膜泵死体积小（约0.10.1mLmL），），），），因此，更换流动因此，更换流动因此，更换流动因此，更换流动相后平衡快，利于梯度洗脱。相后平衡快，利于梯度洗脱。相后平衡快，利于梯度洗脱。相后平衡快，利于梯度洗脱。缺点：缺点：缺点：缺点：结构较复杂，价结构较复杂，价结构较复杂，价结构较复杂，价格较贵，和单活塞机械往复格较贵，和单活塞机械往复格较贵，和单活塞机械往复格较贵，和单活塞机械往复泵一样，也产生脉冲，也需泵一样，也产生脉冲，也需泵一样，也产生脉冲，也需泵一样，也产生脉冲，也需要配置阻尼装置来消除脉冲。要配置阻尼装置来消除脉冲。要配置阻尼装置来消除脉冲。要配置阻尼装置来消除脉冲。Tanghui.pha.shzu1919第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器2.2.脱气装置脱气装置脱气装置脱气装置 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出排出排出排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中这些气泡则很费时间。在荧光检测中这些气泡则很费时间。在荧光检测中这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使溶解氧还会使溶解氧还会使溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液溶液溶液溶液pHpH值发生变化。值发生变化。值发生变化。值发生变化。Tanghui.pha.shzu2020第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器 目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：离线超声波振荡脱气；离线超声波振荡脱气；离线超声波振荡脱气；离线超声波振荡脱气；在线惰性气体（氦气）鼓在线惰性气体（氦气）鼓在线惰性气体（氦气）鼓在线惰性气体（氦气）鼓泡吹扫脱气；泡吹扫脱气；泡吹扫脱气；泡吹扫脱气；在线真空脱气。在线真空脱气。在线真空脱气。在线真空脱气。真空脱气装置：真空脱气装置：真空脱气装置：真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成将流动相通过一段由多孔性合成将流动相通过一段由多孔性合成将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、单流路真空脱气装置的原理单流路真空脱气装置的原理二氧化碳就会从膜内二氧化碳就会从膜内二氧化碳就会从膜内二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。进入膜外而被脱除。进入膜外而被脱除。进入膜外而被脱除。一般真空脱气装置有一般真空脱气装置有一般真空脱气装置有一般真空脱气装置有多条流路，可同时对多条流路，可同时对多条流路，可同时对多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。多个溶液进行脱气。多个溶液进行脱气。多个溶液进行脱气。Tanghui.pha.shzu2121第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu2222第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器3.3.梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯度洗脱装置梯度洗脱装置 在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。离，往往要用到梯度洗脱技术。离，往往要用到梯度洗脱技术。离，往往要用到梯度洗脱技术。HPLCHPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。中改变流动相的组成或浓度。中改变流动相的组成或浓度。中改变流动相的组成或浓度。线性梯度线性梯度线性梯度线性梯度;阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度阶梯梯度 高压梯度高压梯度高压梯度高压梯度低压梯度低压梯度低压梯度低压梯度Tanghui.pha.shzu2323第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器高压梯度装置结构优点：优点：优点：优点：只要通过梯度程序只要通过梯度程序只要通过梯度程序只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，控制器控制每台泵的输出，控制器控制每台泵的输出，控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度就能获得任意形式的梯度就能获得任意形式的梯度就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易曲线，而且精度很高，易曲线，而且精度很高，易曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。于实现自动化控制。于实现自动化控制。于实现自动化控制。缺点：缺点：缺点：缺点：使用了两台高压输使用了两台高压输使用了两台高压输使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更液泵，使仪器价格变得更液泵，使仪器价格变得更液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，昂贵，故障率也相对较高，昂贵，故障率也相对较高，昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操而且只能实现二元梯度操而且只能实现二元梯度操而且只能实现二元梯度操作。作。作。作。Tanghui.pha.shzu2424第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器四元低压梯度系统结构 只需一个高压泵，混合只需一个高压泵，混合只需一个高压泵，混合只需一个高压泵，混合就在泵前安装了一个比例就在泵前安装了一个比例就在泵前安装了一个比例就在泵前安装了一个比例阀中完成。因比例阀是在阀中完成。因比例阀是在阀中完成。因比例阀是在阀中完成。因比例阀是在泵之前，所以是在常压泵之前，所以是在常压泵之前，所以是在常压泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压（低压）下混合，在常压（低压）下混合，在常压（低压）下混合，在常压下混合易形成气泡，常配下混合易形成气泡，常配下混合易形成气泡，常配下混合易形成气泡，常配置在线脱气装置，来自于置在线脱气装置，来自于置在线脱气装置，来自于置在线脱气装置，来自于四种溶液瓶的四根输液管四种溶液瓶的四根输液管四种溶液瓶的四根输液管四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四分别与真空脱气装置的四分别与真空脱气装置的四分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后进条流路相接，经脱气后进条流路相接，经脱气后进条流路相接，经脱气后进入比例阀，混合后从一根入比例阀，混合后从一根入比例阀，混合后从一根入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。输出管进入泵体。输出管进入泵体。输出管进入泵体。Tanghui.pha.shzu2525第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。混合后进入色谱柱。内梯度内梯度内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过比例通过比例调节阀调节阀,将两种或多种不同将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。Tanghui.pha.shzu26264 4进样系统进样系统进样系统进样系统 HPLC柱比柱比GC柱短得多（约柱短得多（约530cm），），所以柱外所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱外展宽可分柱前柱前和和柱后柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此展宽的主要因素，因此HPLC法中对进样技术要求较严。法中对进样技术要求较严。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。进样装置。结构如图所示：结构如图所示：第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu2727第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器（动画动画）Tanghui.pha.shzu28285.5.分离系统分离系统分离系统分离系统色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管柱管与与固定相固定相两部分。两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长一般色谱柱长530cm，内径为内径为45mm，凝胶色谱柱凝胶色谱柱内径内径312mm，制备柱内径较大，可达制备柱内径较大，可达25mm 以上。以上。一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前置柱内填充物和分，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。保证分离柱的性能不受影响。第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu2929第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。一般柱体为直型不锈钢管，内径一般柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。Tanghui.pha.shzu30306 6检测系统检测系统检测系统检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是一类是一类是一类是溶质性检测器溶质性检测器溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或，它仅对被分离组分的物理或，它仅对被分离组分的物理或，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有化学特性有响应，属于这类检测器的有化学特性有响应，属于这类检测器的有化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外紫外紫外紫外、荧光荧光荧光荧光、电电电电化学检测器化学检测器化学检测器化学检测器等。等。等。等。另一类是另一类是另一类是另一类是总体检测器总体检测器总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理，它对试样和洗脱液总的物理，它对试样和洗脱液总的物理，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有或化学性质有响应，属于这类检测器的有或化学性质有响应，属于这类检测器的有或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光示差折光示差折光示差折光，电电电电导检测器导检测器导检测器导检测器等。等。等。等。第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu3131（l l）紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物应用最广，对大部分有机化合物有响应。其特点：有响应。其特点：灵敏度高；灵敏度高；线形范围高；线形范围高；流通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm 10mm，容积容积 8L）；）；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu3232第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器UV/Vis detecterUV/Vis detecterTanghui.pha.shzu3333第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器(2)(2)光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。Tanghui.pha.shzu3434第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu3535第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Photodiode array detecterPhotodiode array detecterTanghui.pha.shzu3636第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器Tanghui.pha.shzu3737二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（DADDAD）优点：优点：第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器1.1.可实施一个样品的全波长扫描，方便快速确定最佳吸收可实施一个样品的全波长扫描，方便快速确定最佳吸收可实施一个样品的全波长扫描，方便快速确定最佳吸收可实施一个样品的全波长扫描，方便快速确定最佳吸收波长。波长。波长。波长。2.2.可同时给出紫外光谱和色谱图，便于组分定性和定量。可同时给出紫外光谱和色谱图，便于组分定性和定量。可同时给出紫外光谱和色谱图，便于组分定性和定量。可同时给出紫外光谱和色谱图，便于组分定性和定量。3.3.提供多种色谱峰纯度判断方法，包括：等高线图法、光提供多种色谱峰纯度判断方法，包括：等高线图法、光提供多种色谱峰纯度判断方法，包括：等高线图法、光提供多种色谱峰纯度判断方法，包括：等高线图法、光谱色谱三维图法、重叠光谱图法、波长比图法和色谱峰谱色谱三维图法、重叠光谱图法、波长比图法和色谱峰谱色谱三维图法、重叠光谱图法、波长比图法和色谱峰谱色谱三维图法、重叠光谱图法、波长比图法和色谱峰纯度计算法等。可进行峰的纯度检测。纯度计算法等。可进行峰的纯度检测。纯度计算法等。可进行峰的纯度检测。纯度计算法等。可进行峰的纯度检测。4.4.可提供各种类型的色谱图，其中包括：单波长色谱图、可提供各种类型的色谱图，其中包括：单波长色谱图、可提供各种类型的色谱图，其中包括：单波长色谱图、可提供各种类型的色谱图，其中包括：单波长色谱图、任意两个波长的吸收比色谱图、波长时间程序色谱图、任意两个波长的吸收比色谱图、波长时间程序色谱图、任意两个波长的吸收比色谱图、波长时间程序色谱图、任意两个波长的吸收比色谱图、波长时间程序色谱图、最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图。其中最大吸最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图。其中最大吸最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图。其中最大吸最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图。其中最大吸收波长色谱图为灵敏度最高的检测方式，而总体吸收色收波长色谱图为灵敏度最高的检测方式，而总体吸收色收波长色谱图为灵敏度最高的检测方式，而总体吸收色收波长色谱图为灵敏度最高的检测方式，而总体吸收色谱图为定量重复性最好的方法。谱图为定量重复性最好的方法。谱图为定量重复性最好的方法。谱图为定量重复性最好的方法。Tanghui.pha.shzu3838第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器 (3)(3)示差折光率检测器示差折光率检测器示差折光率检测器示差折光率检测器 （differential refractive index detectordifferential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；可可可可连连连连续续续续检检检检测测测测参参参参比比比比池池池池和和和和样样样样品品品品池池池池中中中中流流流流动动动动相相相相之之之之间间间间的的的的折折折折光光光光指指指指数差值。差值与浓度呈正比；数差值。差值与浓度呈正比；数差值。差值与浓度呈正比；数差值。差值与浓度呈正比；几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种光检测器是一种光检测器是一种光检测器是一种通用型检测器通用型检测器通用型检测器通用型检测器。灵敏度可达。灵敏度可达。灵敏度可达。灵敏度可达1010-7-7gcmgcm-3-3。主要缺点主要缺点主要缺点主要缺点：对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能：对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能：对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能：对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能用于梯度淋洗。用于梯度淋洗。用于梯度淋洗。用于梯度淋洗。分类：分类：分类：分类：偏转式、反射式和干涉型三种；偏转式、反射式和干涉型三种；偏转式、反射式和干涉型三种；偏转式、反射式和干涉型三种；Tanghui.pha.shzu3939第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器示差折光检测器示差折光检测器Tanghui.pha.shzu4040第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器Tanghui.pha.shzu4141第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器（4 4）荧光检测器）荧光检测器）荧光检测器）荧光检测器（fluorescence detectorfluorescence detector）特点：特点：特点：特点：高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、药药物物、氨基酸、甾类化合物等有响应；氨基酸、甾类化合物等有响应；Tanghui.pha.shzu4242第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器（5 5）电导检测器）电导检测器）电导检测器）电导检测器 conductometric detectorconductometric detector测量溶剂电导率，特别适合于离子溶液。测量溶剂电导率，特别适合于离子溶液。（6 6）电化学检测器）电化学检测器）电化学检测器）电化学检测器 electrochemical detectorelectrochemical detectorTanghui.pha.shzu4343第二节第二节 高效液相色谱仪器高效液相色谱仪器（7 7）电流检测器）电流检测器）电流检测器）电流检测器 AmperometricAmperometric detector detector（8 8）蒸发光散射检测器（）蒸发光散射检测器（）蒸发光散射检测器（）蒸发光散射检测器（ELSDELSD）Evaporative light scattering detector Evaporative light scattering detector 由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。Tanghui.pha.shzu4444 色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗粒电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折